【摘要】：胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)是一種高度惡性、高侵襲性消化系統(tǒng)腫瘤,目前治療效果欠佳,5年生存率仍然很低,多數(shù)報道在5%～10%。胰腺癌患者發(fā)病早期的臨床表現(xiàn)不典型,癥狀隱匿,約80%的患者在確診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,因此錯過了最佳手術(shù)治療時機,只有不足20%的病人有機會接受根治性切除手術(shù),且胰腺癌患者對一般的化療藥物易出現(xiàn)耐藥性,對放療的敏感性亦差強人意,嚴重影響了胰腺癌患者治療效果。因此尋找胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中有效的診斷和治療靶標成為目前研究的重點。microRNAs(miRNAs)是一類長度為19-24個核酸的非編碼單鏈RNA,它可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控促使目標基因mRNA發(fā)生降解或轉(zhuǎn)錄抑制。研究顯示microRNAs在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及耐藥過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,提示miRNAs在腫瘤診斷、預(yù)后評價及治療等方面有著較高的應(yīng)用價值。miR-494是由位于染色體14q32.31上的基因所編碼,研究認為miR-494具有抑癌基因作用,在多種癌癥組織中均可檢測到miR-494表達水平的下調(diào),如胃癌、膽管癌、淋巴癌及肺癌等。Olaru等發(fā)現(xiàn)miR-494可與CDK6的3'-UTR區(qū)結(jié)合引起膽管癌細胞周期阻滯,抑制其增殖。在胰腺癌中,劉洋等證實miR-494可通過靶向c-Myc和SIRT1發(fā)揮促胰腺癌細胞凋亡作用,此外,miR-494還可增強胰腺癌細胞對5-Fu和GEM藥物敏感性,提示miR-494可作為胰腺癌基因治療的潛在靶點。鋅指蛋白Gli3是Sonic Hedgehog(SHH)信號下游轉(zhuǎn)錄因子,研究顯示Gli3在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用,它可通過SHH信號通路直接與抗凋亡因子啟動子結(jié)合發(fā)揮抗凋亡作用。Hironori Iwasaki等發(fā)現(xiàn)低分化結(jié)腸癌患者組織Gli3陽性率明顯高于中高分化組,給予小鼠注射Gli3過表達DLD-1細胞可促腫瘤形成,提示Gli3可能有促直腸癌發(fā)生作用。文善云等證實宮頸癌中抑癌因子miR-506與Gli3表達呈負相關(guān)性,瞬轉(zhuǎn)si-Gli3可使宮頸癌細胞的增殖活性減弱,而外源性導(dǎo)入Gli3基因可拮抗miR-506對宮頸癌細胞的抑制作用,表明G1 i3在宮頸癌發(fā)生過程中可能具有類似原癌基因效果。此外,Gli3還可間接啟動上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化,交聯(lián)SHH-EMT信號促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。我們應(yīng)用TargetScan、miRbase和miRanda生物信息學(xué)軟件預(yù)測Gli3可能是miR-494的潛在靶點,由此我們推測,miR-494可能通過干預(yù)Gli3轉(zhuǎn)錄參與調(diào)控胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究應(yīng)用免疫組化、分子生物學(xué)及靶向基因調(diào)控技術(shù)探討miR-494在胰腺癌進展惡化中的可能作用,闡明了miR-494在胰腺癌病理過程中的作用機制,為今后胰腺癌的臨床診斷及靶向治療提供理論和數(shù)據(jù)支持。研究目的明確胰腺癌患者胰腺癌組織和癌旁正常組織miR-494 mRNA表達水平,分析miR-494 mRNA表達水平與胰腺癌患者臨床指標及預(yù)后相關(guān)性;探討胰腺癌患者組織內(nèi)Gli3 mRNA及蛋白表達水平,分析Gli3與miR-494及患者臨床特征的相關(guān)性;驗證miR-494對Gli3的靶向調(diào)控作用,探討miR-494與Gli3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控機制。研究方法1.收集胰腺癌組織及配對癌旁正常組織共99例,熒光定量PCR法檢測組織中miR-494 mRNA表達水平,分析miR-494與患者臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)性,Cox比例風(fēng)險模型分析胰腺癌OS影響因素;2.熒光定量PCR法及Western-blot法檢測胰腺癌患者組織中Gli3 mRNA及蛋白表達水平,分析Gli3 mRNA與患者臨床病理特征及miR-494表達相關(guān)性;3.給予胰腺癌細胞PANC-1轉(zhuǎn)染hsa-miR-494mimics/inhibitor,干預(yù)PANC-1 細胞miR-494表達水平,CCK-8和Transwell法檢測轉(zhuǎn)染細胞增殖和遷移活性,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-494對Gli3的靶向調(diào)控作用。結(jié)果1.胰腺癌患者病灶組織內(nèi)miR-494 mRNA表達水平明顯低于癌旁正常組織(p0.05),其mRNA相對表達量分別為(0.48±0.11)和(1.80±0.28)。參照胰腺癌組織中miR-494 mRNA相對表達量,選定中位值作為截斷點,將99例胰腺癌患者劃分為miR-494低表達組和miR-494高表達組,用于臨床病理相關(guān)性分析。2.miR-494表達水平與胰腺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、血管侵襲、TNM分期及分化程度密切相關(guān)(p0.05),與患者的年齡、腫瘤大小和性別無明顯相關(guān)性。3.miR-494高表達組和低表達組5年生存率分別為49.2%和12.0%;與miR-494低表達組患者相比,miR-494高表達組患者有著更長生存時間(p0.05),提示miR-494表達水平與胰腺癌預(yù)后相關(guān)。4.性別、年齡、腫瘤大小、位置、分化程度不是OS的獨立危險因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=2.92,95%CI= 1.37-10.39,P=0.016)、血管侵襲(HR=2.18,95%CI=1.03-16.86,P=0.008)、遠處轉(zhuǎn)移(HR=3.03,95%CI= 2.15-18.92,P=0.012)、TNM 分期(HR=2.98,95%CI= 1.88-14.12,P=0.007)、miR-494 mRNA 表達(HR=2.85,95%CI=1.54-8.45,P=0.019)為胰腺癌患者預(yù)后OS的獨立影響因素,表明miR-494可用于胰腺癌總生存期的預(yù)測。5.99例胰腺癌患者組中,Gli3 mRNA陽性表達病例數(shù)為45例(45.5%),癌旁組織中Gli3 mRNA陽性表達病例數(shù)為9例(9.1%)。胰腺癌患者病灶組織內(nèi)Gli3 mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織(p0.05),其mRNA相對表達量分別為(0.68±0.25)和(0.50±0.24)。參照胰腺癌組織中Gli3mRNA相對表達量,將99例胰腺癌患者劃分為Gli3陽性表達組和Gli3陰性表達組,用于臨床病理相關(guān)性分析。6.Western-blot法分析胰腺癌患者病灶組織和癌旁正常組織內(nèi)Gli3-FL和Gli3R的表達情況,分析Gli3-FL與Gli3R相對蛋白表達水平并探討二者比值變化,結(jié)果顯示99例胰腺癌患者組中,Gli3蛋白陽性表達病例數(shù)為40例(40.4%),癌旁組織中Gli3蛋白陽性表達病例數(shù)為9例(9.1%)。胰腺癌患者病灶組織及癌旁組織Gli3-FL的蛋白表達相對量分別為0.50±0.41和0.34±0.21,與癌旁組織相比,胰腺癌患者病灶組織內(nèi)Gli3-FL蛋白表達水平顯著升高(p0.05),兩組間Gli3R表達水平無明顯差異,計算Gli3-FL與Gli3R比值,可見胰腺癌患者病灶組織Gli3-FL與Gli3R比值明顯高于癌旁正常組織,表明胰腺癌患者組織內(nèi)Gli3主要以全長形式存在,提示Gli3在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有轉(zhuǎn)錄激活子作用。7.Gli3mRNA表達水平與患者性別(χ2=0.11,p=0.74)、年齡(χ2=1.75,p=0.19)、腫瘤部位(χ2=0.14,p=0.71)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=2.85,p=0.09)、TNM分期(X2=3.26,p=0.07)等臨床參數(shù)無關(guān),但與血管侵襲(χ2=4.25,p=0.04)、遠處轉(zhuǎn)移(χ2=10.43,p=0.001)及分化程度(χ2=4.93,p=0.03)相關(guān),提示發(fā)生血管侵襲及遠處轉(zhuǎn)移胰腺癌患者組織Gli3 mRNA表達水平顯著高于無血管侵襲和遠處轉(zhuǎn)移患者,低分化度胰腺癌患者組織Gli3 mRNA表達水平顯著高于中高分化患者組。8.Pearson correlation法分析證實胰腺癌癌組織中miR-494與Gli3 mRNA表達具有相關(guān)性(r2=0.3119,P=0.004)。9.miR-494 mimics轉(zhuǎn)染后,PANC-1細胞中miR-494 mRNA表達水平顯著上調(diào)(P0.01),轉(zhuǎn)染 miR-494 inhibitor 后,PANC-1 細胞中 miR-494 mRNA 表達水平明顯降低(P0.01),提示miR-494 mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染后可有效干預(yù)PANC-1細胞中miR-494 mRNA表達水平。10.CCK-8試劑盒檢測miR-494 mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染后PANC-1細胞增殖活性,miR-494表達上調(diào)可顯著拮抗PANC-1細胞增殖活性(P0.01),轉(zhuǎn)染inhibitor下調(diào)miR-494表達可使PANC-1細胞增殖活性增強(P0.01)。11.應(yīng)用Transwell細胞體外遷移實驗分析miR-494 mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染后PANC-1細胞遷移能力,miR-494表達水平上調(diào)后PANC-1體外遷移能力下降(P0.01),表明miR-494可抑制胰腺癌細胞PANC-1的體外遷移能力;miR-494表達抑制后,PANC-1遷移能力顯著增強(P0.01)。12.利用生物信息學(xué)軟件(miRanda、TargetScan和miRDB)預(yù)測分析miR-494潛在作用靶點,發(fā)現(xiàn)miR-494可與Gli3的3'-UTR區(qū)結(jié)合,我們根據(jù)結(jié)合位點構(gòu)建了Gli3 3'-UTR雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒,熒光素酶報告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示Gli3的3'-UTR野生型雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒與miR-494共轉(zhuǎn)染24 h后,可見其螢光素酶活性降低(P0.05),表明miR-494可直接作用于Gli3的3'-UTR區(qū)。結(jié)論1.胰腺癌患者病灶組織miR-494 mRNA呈低表達,并與胰腺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、血管侵襲、TNM分期及臨床病理分型及預(yù)后密切相關(guān)。2.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-494 mRNA表達為胰腺癌患者預(yù)后OS的獨立影響因素,檢測miR-494水平有助于胰腺癌病人的預(yù)后判斷。3.Gli3在胰腺癌患者病灶組織呈現(xiàn)高表達,并與患者血管侵襲、遠處轉(zhuǎn)移、分化程度正相關(guān),與組織中與miR-494負相關(guān)。4.miR-494表達上調(diào)可顯著拮抗PANC-1細胞增殖和遷移活性,Gli3作為miR-494靶基因之一參與介導(dǎo)了 miR-494對胰腺癌細胞的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9
【圖文】：

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【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2772990