【摘要】：目的:肺癌,是目前世界上診斷率第二高的癌癥,也是全世界所有癌癥相關(guān)死亡的主要原因,肺癌的發(fā)病率也在呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢。大約有百分之八十五到百分之九十的肺癌患者被診斷為非小細(xì)胞肺癌。目前為止,在可行的情況下,外科手術(shù)是治療非小細(xì)胞肺癌的最佳治療策略,然而,即使患者接受了最及時的外科手術(shù)治療達(dá)到治愈,也可能會發(fā)生局部的,或者是全身系統(tǒng)性的轉(zhuǎn)移并且最終死于肺癌。肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲,與肺癌的死亡率直接相關(guān),而肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲主要與一些關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān),因此,發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)基因,以及揭示這些基因的功能在治療肺癌中十分重要。Notch信號通路在發(fā)育,細(xì)胞增殖,細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡方面的作用已經(jīng)有很多報道,一些研究表明,Notch信號通路涉及到一些癌癥的惡性表型,例如乳腺癌和T細(xì)胞白血病等惡性腫瘤。肺癌中,Notch信號通路的作用研究是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中進(jìn)行的,研究發(fā)現(xiàn),激活的Notch信號通路在肺泡上皮中表達(dá)增多,能夠協(xié)同Myc通路,對非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展起到促進(jìn)作用。另一個研究中指出,Notch1能夠通過調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性,從而抑制p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡,影響肺腺癌的生長。Notch信號通路通過配體-受體結(jié)合作用激活通路。其中涉及到五種配體,DLL1,DLL3,DLL4,Jagged-1和Jagged-2,以及四種受體,Notch1,Notch2,Notch3和Notch4。與配體的結(jié)合誘導(dǎo)一系列Notch構(gòu)象上的變化,導(dǎo)致S2位點的暴露,在金屬蛋白酶、腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)換酶作用下,裂解為2個片段,氮端裂解產(chǎn)物為胞外區(qū),被配體表達(dá)細(xì)胞吞噬,碳端的裂解產(chǎn)物在跨膜區(qū)的第三個裂解點S3,經(jīng)過主要為γ-secretase的成分裂解,釋放出Notch蛋白的活性形式,即NICD。NICD進(jìn)入細(xì)胞核,發(fā)揮功能。NICD的靶基因主要有cyclin D1,c-Myc,p21,p27,nuclear factor-kappa B(NF-κB),survivin,slug和Nanog,這些靶基因都具有促進(jìn)癌癥發(fā)生和發(fā)展的作用。KIAA0247是一個編碼303個氨基酸的I型跨膜蛋白,在各個物種間高度保守。盡管,在癌癥中,沒有發(fā)現(xiàn)KIAA0247的突變,KIAA0247由于啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了p53的結(jié)合位點而受到關(guān)注,被認(rèn)為是一個潛在的抑癌基因。KIAA0247曾經(jīng)被一個研究者命名為DRAGO(drug-activated gene overexpressed),意思為藥物誘導(dǎo)下的基因過表達(dá),因為在多種抗腫瘤藥物,例如順鉑、烷化劑、抗代謝藥物、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑、紫杉烷類,以及Nutlin-3的作用下,HCT116 p53+/+和HCT116 p53+/-細(xì)胞出現(xiàn)KIAA0247表達(dá)量2到4倍的增多,而在HCT116 p53-/-細(xì)胞中,則不出現(xiàn)KIAA0247增多的現(xiàn)象。KIAA0247的過表達(dá)也同樣出現(xiàn)在5氟尿嘧啶治療后,在結(jié)腸癌患者中,糞便中KIAA0247的m RNA表達(dá)量高的一組,較表達(dá)量低的一組有著更好的預(yù)后。在卵巢癌中,進(jìn)展期腫瘤KIAA0247的m RNA表達(dá)量較初期腫瘤中的m RNA表達(dá)量有大約百分之三十的降低。另一個研究表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中,KIAA0247的m RNA表達(dá)量較正常腦組織少,并且KIAA0247的過表達(dá),通過抑制AKT和Stat3信號通路,從而抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的增殖和惡性表型,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。KIAA0247基因位于人類染色體14q24.1,這一部分染色體包含了SERPINA1基因,這一基因與α-抗胰蛋白酶缺乏有關(guān),能夠?qū)е路谓M織損傷,肺氣腫和肺癌的發(fā)生。然而,KIAA0247在肺癌中的生物學(xué)行為方面的作用尚不清楚,并且關(guān)于KIAA0247與肺癌臨床病理的相關(guān)性也尚無報道。在我們的研究中,旨在探究KIAA0247的m RNA和蛋白表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性,以及研究KIAA0247的表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞系的細(xì)胞生物學(xué)行為關(guān)系,及其潛在的詳細(xì)分子生物學(xué)機(jī)制與其參與調(diào)控的過程。研究方法:1.免疫組織化學(xué)染色實驗選取了2013年到2015年,在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌病例197例進(jìn)行臨床病理相關(guān)性分析。所有參與到本次病理相關(guān)性分析的197例患者,均未接受過手術(shù)前的化療和放療。男性患者(N=127例),女性患者(N=70例),年齡在30至90歲之間。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control,UICC)第八版肺癌TNM分期系統(tǒng),根據(jù)病理信息,Ⅰ期患者(N=83例),Ⅱ期和Ⅲ期患者共(N=114例)。根據(jù)WHO分類系統(tǒng),組織學(xué)診斷和組織分化程度方面,鱗狀細(xì)胞癌(N=101例),腺癌(N=96例),中分化至高分化(N=126例),低分化(N=71例)。腫瘤大小分類,小于等于三厘米病例(N=108例),大于三厘米病例(N=89例)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例(N=84例),淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移病例(N=113例)。通過免疫組織化學(xué)染色實驗,進(jìn)行染色檢測,所有切片的染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占百分比,進(jìn)行半定量計分評價,結(jié)果進(jìn)行雙盲的臨床數(shù)據(jù)分析,其中,根據(jù)染色強(qiáng)度,KIAA0247表達(dá)水平評定分?jǐn)?shù)設(shè)為:0分(不表達(dá)),1分(弱表達(dá),淡黃色顆粒),2分(中等強(qiáng)度表達(dá),黃色顆粒),3分(強(qiáng)表達(dá),棕色顆粒);染色細(xì)胞所占百分比評定分?jǐn)?shù)為:0分(0%),1分(1%-30%),2分(31%-70%),3分(71%-100%)。在單例樣本病理切片中,染色強(qiáng)度的得分與染色細(xì)胞所占百分比得分進(jìn)行乘積,最終得分在0到9分之間,用最終乘積分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。腫瘤樣本病理切片得分大于三分的,被認(rèn)定為KIAA0247陽性表達(dá),小于或者等于三分的病例被認(rèn)定為是KIAA0247低表達(dá)。使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析,使用單樣本配對t檢驗方法,分析KIAA0247表達(dá)水平與臨床病理相關(guān)因素間的統(tǒng)計學(xué)關(guān)系。以P值小于0.05為標(biāo)準(zhǔn),界定是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.我們隨機(jī)選取35例手術(shù)術(shù)中取出的新鮮非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本,包括腫瘤組織和相鄰的正常肺組織,進(jìn)行real-time PCR檢測KIAA0247的m RNA表達(dá)水平,利用SPSS16.0軟件,選取單樣本配對t檢驗方法,分析KIAA0247的m RNA水平是否具有臨床病理相關(guān)性。利用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫,分析KIAA0247與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。實驗組從中科院上海細(xì)胞庫購買常用的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系,按照細(xì)胞庫官方網(wǎng)站公開的培養(yǎng)配方,使用Gibco 1640培養(yǎng)基,添加10%胎牛血清,無水葡萄糖,碳酸氫鈉,丙酮酸鈉,培養(yǎng)A549,H292,H1299,H460,H661細(xì)胞系,使用Gibco MEM培養(yǎng)基,添加10%胎牛血清,無水葡萄糖,碳酸氫鈉,丙酮酸鈉,培養(yǎng)SK-MES-1細(xì)胞系,使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人類正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE細(xì)胞。所有細(xì)胞,均在無菌、有濾孔的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),在無菌六孔板中進(jìn)行處理。3.將細(xì)胞爬片放入細(xì)胞培養(yǎng)24孔板中,將不同種細(xì)胞系的細(xì)胞,鋪于孔板中,待貼壁在細(xì)胞爬片之后,PBS洗凈,4%多聚甲醛固定10—15分鐘,用0.1%Triton X-100透膜打孔10-15分鐘,用非免疫胎牛血清白蛋白封閉兩個小時,目標(biāo)KIAA0247抗體在4℃敷育過夜,熒光二抗避光敷育兩個小時,最后避光條件下DAPI染細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下,激發(fā)目標(biāo)光,觀察KIAA0247在各種細(xì)胞系中的定位及相對表達(dá)情況。4.利用Lipofectamine 3000,向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)KIAA0247 si-RNA和KIAA0247質(zhì)粒,達(dá)到下調(diào)和上調(diào)KIAA0247目標(biāo)蛋白表達(dá)的目的,為后續(xù)細(xì)胞功能學(xué)實驗提供基礎(chǔ)。在無菌細(xì)胞六孔培養(yǎng)板中同步細(xì)胞周期,下調(diào)或是上調(diào)KIAA0247的蛋白表達(dá)水平,收集沒有互相貼緊的細(xì)胞,固定、染色,使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化,分析KIAA0247對細(xì)胞周期方面的影響。5.在無菌細(xì)胞六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞,下調(diào)或是上調(diào)KIAA0247的蛋白表達(dá)水平,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),每組間以同樣數(shù)量,同等重復(fù)復(fù)孔,接種到96孔培養(yǎng)板,一共五板,連續(xù)五天,每天定時加MTT,檢測細(xì)胞連續(xù)增殖能力。6.在無菌細(xì)胞六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞,下調(diào)或是上調(diào)KIAA0247蛋白表達(dá)水平,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),每組間以相同數(shù)量,重復(fù)三次復(fù)孔,接種到新的無菌六孔培養(yǎng)板中,連續(xù)培養(yǎng)10-15天,待細(xì)胞集落形成,收取培養(yǎng)板,固定、染色,計數(shù)集落形成數(shù)量和大小,分析細(xì)胞集落形成能力中KIAA0247的作用。7.在無菌細(xì)胞六孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞,下調(diào)或是上調(diào)KIAA0247目標(biāo)蛋白表達(dá),進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),按組間相同數(shù)量鋪于transwell小室上室,同等時間取出transwell小室,固定、染色、去除上室細(xì)胞,計數(shù)下室細(xì)胞。上室鋪基質(zhì)膠時,用以檢測KIAA0247對細(xì)胞侵襲能力的影響,不鋪基質(zhì)膠時,用以檢測KIAA0247對細(xì)胞遷移能力的影響。8.經(jīng)過下調(diào)或是上調(diào)KIAA0247蛋白表達(dá)的細(xì)胞,收集細(xì)胞,使用NP40蛋白裂解液進(jìn)行裂解,并收集細(xì)胞總蛋白,通過蛋白免疫印跡實驗對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)的蛋白進(jìn)行檢測和分析,尋找可能的作用通路。9.利用蛋白免疫印跡實驗結(jié)果分析出KIAA0247可能通過Notch信號通路發(fā)揮肺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為功能的影響,使用Notch信號通路抑制劑DAPT,特異性抑制Notch信號通路,驗證KIAA0247抑制非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為是通過Notch信號通路發(fā)揮作用。結(jié)果:1.KIAA0247定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。在臨床肺癌病例中,肺癌組織中KIAA0247的m RNA表達(dá)水平顯著低于癌旁正常肺組織,臨床病理相關(guān)性分析中,KIAA0247蛋白表達(dá)水平與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、P-TNM分期有相關(guān)性,但是與患者年齡、患者性別、腫瘤分型以及腫瘤大小沒有相關(guān)性。Kaplan-Meier分析KIAA0247與肺腺癌患者預(yù)后有相關(guān)性。2.在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中,KIAA0247能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系增殖能力,抑制細(xì)胞周期G1向S期轉(zhuǎn)變。3.在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中,KIAA0247能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。4.蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)KIAA0247能夠調(diào)控增殖,遷移,侵襲相關(guān)功能蛋白,并且負(fù)向調(diào)控EMT相關(guān)蛋白,經(jīng)過分析,能夠抑制Notch信號通路的激活。5.Notch信號通路抑制劑DAPT作用后,結(jié)合功能學(xué)實驗,以及蛋白免疫印跡實驗分析,確定KIAA0247通過Notch信號通路發(fā)揮對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為抑制方面的作用。結(jié)論:1.KIAA0247在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá),并且KIAA0247表達(dá)與癌細(xì)胞的分化程度和非小細(xì)胞肺癌患者的存活率呈正相關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,肺癌分期呈負(fù)相關(guān)2.KIAA0247通過p21-Cyclin D1-CDK4軸的調(diào)控造成G1/S期的阻滯,從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力3.KIAA0247通過下調(diào)Rho A,Rho C,MMP9,上調(diào)Rho B,抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力3.KIAA0247負(fù)向調(diào)控Notch信號通路從而抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖,遷移和侵襲能力
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

圖 3.2.1 免疫熒光檢測 KIAA0247 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況（200 X）圖中紅色熒光顯示 TRITC 標(biāo)記的 KIAA0247 蛋白，藍(lán)色熒光顯示 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核，Merge 為合并圖層后，顯示出 KIAA0247 的定位在細(xì)胞核和細(xì)胞漿均有關(guān)于 KIAA0247 是否具有臨床病理學(xué)相關(guān)性，我們選取了 197 例接受臨床外科手術(shù)治療患者的病理標(biāo)本，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測 KIAA0247 的定位和相對表達(dá)情況。在肺腺癌和肺鱗癌中，KIAA0247 定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，我們對所有表達(dá)的 KIAA0247 進(jìn)行統(tǒng)計評分。在正常肺支氣管和肺泡中，KIAA0247 的表達(dá)量較肺癌組織中 KIAA0247 表達(dá)水平高，隨著分化程度提高，KIAA0247 表達(dá)水平呈增多趨勢（圖 3.2.2）。

13圖 3.2.2 KIAA0247 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況（200 X）圖中Ⅰ為 KIAA0247 在正常肺泡組織中強(qiáng)陽性表達(dá)，Ⅱ為 KIAA0247 在肺正常支氣管中的強(qiáng)陽性表達(dá)，Ⅲ和Ⅳ分別為 KIAA0247 在高分化鱗癌和高分化腺癌組織中的表達(dá)情況，Ⅴ和Ⅵ分別為 KIAA0247 在低分化鱗癌 和低分化腺癌組織中的表達(dá)組織中低表達(dá)的情況經(jīng)過染色強(qiáng)度和染色范圍評分的乘積得分，對 197 例非小細(xì)胞肺癌病理免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，KIAA0247 的表達(dá)水平與臨床病理因素中年齡（P=0.865），性別（P=0.119），組織學(xué)分型（P=0.311）和腫瘤大�。≒=0.134）無統(tǒng)計學(xué)意義，

14圖 3.2.3 KIAA0247 免疫組化表達(dá)水平與臨床病理因素相關(guān)性圖中 KIAA0247 表達(dá)與分化程度（P＜0.001），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001），TNM 分期（P＜0.001）存在相關(guān)關(guān)系，而與年齡（P=0.865），性別（P=0.119），組織學(xué)分型（P=0.311）和腫瘤大�。≒=0.134）沒有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性此外，選取 35 對臨床新鮮離體的肺癌組織和配對的癌旁正常肺組織新鮮標(biāo)本，提取組織 RNA，利用實時定量 real-time PCR 技術(shù)，檢測組織標(biāo)本中 KIAA0247 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在肺癌腫瘤組織中，KIAA0247 mRNA 表達(dá)水平明顯低于配對的正常肺組織，經(jīng)過 SPSS 單樣本配對 t 檢驗分析，KIAA0247 在癌組織和癌旁正常肺組織的表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（圖 2.3.4）。

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