【摘要】：研究目的:乳腺癌(breast cancer)是女性中較為常見的惡性腫瘤之一,其轉(zhuǎn)移已成為乳腺癌患者死亡的主要原因,同時當(dāng)乳腺癌細胞處于缺氧狀態(tài)時能增加轉(zhuǎn)移能力。腫瘤血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry)是由腫瘤細胞圍成的一種血液供應(yīng)模式,它的存在影響著病人的不良預(yù)后且與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正性相關(guān)關(guān)系。腫瘤蛋白P53誘導(dǎo)核蛋白1(TP53INP1)是一種壓力誘導(dǎo)蛋白,作為一種抑癌蛋白,在多種腫瘤中起到抑制其發(fā)生發(fā)展的作用,研究發(fā)現(xiàn)TP53INP1能抑制多種腫瘤的轉(zhuǎn)移,但是TP53INP1在乳腺癌血管生成擬態(tài)中研究機制尚未明確。本研究探討TP53INP1在乳腺癌血管生成擬態(tài)(VM)及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)形成中的作用,并進一步闡明了其在缺氧微環(huán)境中參與的分子機制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為乳腺癌的抗血管藥物治療及抑制轉(zhuǎn)移提供新的思路繼而提高患者的生存率。研究方法:1.收集100例由有資歷的病理醫(yī)師確診后的乳腺癌組織標(biāo)本,其標(biāo)本由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除所獲得,通過免疫組織化學(xué)和CD31/PAS雙重染色方法觀察TP53INP1的表達情況和VM存在的情況,并進行臨床病理資料分析,TP53INP1與VM在乳腺癌中兩者的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法對TP53INP1和VM進行生存分析。2.利用免疫組織化學(xué)方法檢測100例乳腺癌組織中HIF-1α、VE-cadherin、Snail的表達情況,通過卡方檢驗分析TP53INP1與HIF-1α、VE-cadherin、Snail的差異,Pearson統(tǒng)計方法分析TP53INP1與HIF-1α、VE-cadherin之間的相關(guān)性。3.從四種乳腺癌細胞系中(HS-578T、MDA-MB-231、MCF-7、T-47D)通過Western blot檢測TP53INP1本底表達情況篩選兩種細胞系。通過慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒TP53INP1進入目標(biāo)細胞,篩出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的上下調(diào)TP53INP1乳腺癌細胞系。4.通過劃痕,遷移侵襲,三維培養(yǎng)功能實驗觀察TP53INP1對乳腺癌細胞遷移侵襲,成管能力的影響。通過Western blot實驗,免疫熒光實驗證實上下調(diào)TP53INP1后EMT相關(guān)蛋白指標(biāo)(E-cadherin、Vimentin、Snail、GSK-3β、p-GSK-3β),VM相關(guān)蛋白指標(biāo)(VE-cadherin、MMP2、HIF-1α)的表達的情況。5.在轉(zhuǎn)染的細胞系中加入缺氧誘導(dǎo)劑Co Cl2建立缺氧模型,重復(fù)上述功能實驗以及Western blot實驗證明在缺氧環(huán)境下TP53INP1對乳腺癌遷移侵襲能力,EMT形成及VM形成的影響。6.通過流式細胞術(shù)檢測加入活性氧抑制劑NAC乳腺癌MDA-MB-231細胞系的ROS水平以及上下調(diào)后及缺氧環(huán)境下轉(zhuǎn)染的上下調(diào)TP53INP1乳腺癌細胞系中活性氧(ROS)的水平,并且加入ROS抑制劑NAC后通過Western blot檢測EMT和VM相關(guān)蛋白表達的情況。以及通過三維培養(yǎng)及Western blot觀察加入抑制劑NAC后的成管情況,以及VE-cadherin和HIF-1α蛋白表達情況。7.通過Western blot實驗對共轉(zhuǎn)染過表達TP53INP1和下調(diào)HIF-1αMDA-MB-231細胞系和共轉(zhuǎn)染低表達TP53INP1和下調(diào)HIF-1αMCF-7細胞系VM相關(guān)指標(biāo)的檢測,初步證實TP53INP1和HIF-1α之間的相互作用。8.選取天津醫(yī)科大學(xué)培育的自發(fā)性乳腺癌津白2小鼠模型,通過Western blot從五種不同的自發(fā)性乳腺癌中篩選出與MDA-MB-231與MCF-7兩種細胞系TP53INP1表達一致的兩種自發(fā)瘤。在瘤內(nèi)注入上調(diào)或下調(diào)TP53INP1質(zhì)粒觀察腫瘤的生長情況,通過免疫組化和endomucin/PAS雙染技術(shù)檢測該腫瘤TP53INP1表達情況,存在VM情況和EMT和VM相關(guān)指標(biāo)(E-cadherin、Snail、HIF-1α、MMP2、VE-cadherin)表達情況。研究結(jié)果:1.在人乳腺癌組織標(biāo)本中,64例(64/100)TP53INP1蛋白呈低表達或不表達。TP53INP1高表達在胞漿和核中可見,與TNM分期(P=0.005),淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.015),是否是三陰(P=0.012)和VM(P=0.009)呈負相關(guān)關(guān)系。其中73例中的癌組織TP53INP1的表達較對應(yīng)的癌旁組織降低,且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.045)。TP53INP1與VM呈負性相關(guān)(P=0.009),Kaplan-Meier分析表明100例患者VM和低表達TP53INP1與不良預(yù)后有關(guān)。2.卡方檢驗顯示TP53INP1與HIF-1α(P=0.012),VE-cadherin(P=0.044),Snail(P=0.001)的表達呈負性相關(guān)關(guān)系,且具有統(tǒng)計學(xué)意義。Pearson分析顯示TP53INP1與HIF-1α(r=-0.0293,P=0.003)、VE-cadherin(r=-0.0227,P=0.023)具有負性相關(guān)關(guān)系。3.通過Western blot檢測兩種三陰乳腺癌細胞系(MDA-MB-231和HS-578T),兩種非三陰乳腺癌細胞系(MCF-7和T-47D)TP53INP1的表達情況,篩選出TP53INP1表達能力最強的(MCF-7)和表達能力最弱的(MDA-MB-231)兩種細胞系。將MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染上調(diào)TP53INP1質(zhì)粒,MCF-7細胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)TP53INP1質(zhì)粒。4.建立穩(wěn)轉(zhuǎn)的上下調(diào)質(zhì)粒的乳腺癌細胞系后,實驗結(jié)果顯示上調(diào)TP53INP1的MDA-MB-231細胞系侵襲能力,傷口愈合能力以及成管能力較對照組明顯減弱(P0.005),同理,下調(diào)TP53INP1后的MCF-7細胞侵襲能力,傷口愈合能力以及成管能力較對照組明顯增強(P0.005)。通過Western blot上調(diào)TP53INP1MDA-MB-231細胞系中E-cadherin、GSK-3β的蛋白表達較對照組表達上升,Vimentin、Snail、p-GSK-3β、VE-cadherin、MMP2、HIF-1α蛋白表達較對照組表達下降(P0.005)。下調(diào)TP53INP1的MCF-7細胞系出現(xiàn)相反的結(jié)果(P0.005)。5.Co Cl2處理后,過表達TP53INP1組較對照組遷移侵襲能力以及成管能力較對照組有所降低,Western blot顯示:E-cadherin、GSK-3β的蛋白表達增加,Vimentin、Snail、GSK-3β磷酸化,VE-cadherin、MMP2、HIF-1α蛋白表達較對照組表達降低(P0.005)。下調(diào)TP53INP1后的MCF-7細胞系遷移侵襲能力,成管能力較對照組有所升高,Western blot顯示:E-cadherin、GSK-3β的蛋白表達降低,Vimentin、Snail、GSK-3β磷酸化,VE-cadherin、MMP2、HIF-1α蛋白表達較對照組表達升高(P0.005)。6.流式結(jié)果顯示:Co Cl2處理后,MDA-MB-231細胞產(chǎn)生的ROS較對照組增加,加入活性氧抑制劑NAC后ROS降低,上調(diào)TP53INP1處理后ROS較對照組降低,加入NAC后變化并不明顯;在MCF-7細胞系中,經(jīng)下調(diào)處理的TP53INP1細胞中產(chǎn)生的ROS增加,但是加入NAC后ROS同樣也減低。加入活性氧抑制劑NAC不同濃度處理后,乳腺癌細胞ROS產(chǎn)生的含量、成管能力,以及VE-cadherin和HIF-1α的表達隨之降低,其中濃度為20m M時為最低。7.無論是否加入Co Cl2化學(xué)誘導(dǎo)劑在MDA-MB-231細胞系中共轉(zhuǎn)染上調(diào)TP53INP1和下調(diào)HIF-1α質(zhì)粒VE-cadherin和MMP2的表達較對照組降低,敲除TP53INP1的MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染下調(diào)HIF-1α質(zhì)粒,VE-cadherin和MMP2的蛋白表達較對照組表達增加。8.在TA2小鼠模型中,注入TP53INP1過表達質(zhì)粒的高轉(zhuǎn)移組瘤子生長速度較高轉(zhuǎn)移組對照組明顯降低(P0.005),sh TP53INP1-低轉(zhuǎn)移組瘤子較對照組生長增強;TP53INP1-高轉(zhuǎn)移組形成VM的管道明顯減少,sh TP53INP1-低轉(zhuǎn)移組可見增多;通過免疫組織化學(xué)方法檢測到TP53INP1-高轉(zhuǎn)移組中EMT和VM相關(guān)指標(biāo):E-cadherin表達增加,HIF-1α,Snail,VE-cadherin,MMP2表達相對降低,與體外實驗結(jié)果一致,sh TP53INP1-低轉(zhuǎn)移組EMT和VM相關(guān)指標(biāo):E-cadherin表達降低,HIF-1α、Snail、VE-cadherin和MMP2的表達較對照組升高。研究結(jié)論:1.在人乳癌組織標(biāo)本中,TP53INP1與乳腺癌分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及VM的存在呈負相關(guān)關(guān)系,而且與病人的不良預(yù)后有關(guān)。2.通過體外和體內(nèi)實驗,TP53INP1不僅抑制乳腺癌細胞遷移侵襲及成管能力,而且抑制EMT和VM相關(guān)蛋白的表達及形成。3.在缺氧環(huán)境中,TP53INP1抑制了缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌遷移侵襲,成管能力以及EMT和VM的形成。并初步證實TP53INP1可抑制HIF-1α介導(dǎo)的VM的形成。4.在乳腺癌細胞中,ROS促進乳腺癌細胞VM的形成。5.初步探討了在乳腺癌中,TP53INP1抑制缺氧誘導(dǎo)的EMT和VM的形成通過ROS介導(dǎo)的GSK-3β/Snail信號通路的參與。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

圖 1.1 100 例乳腺癌組織標(biāo)本 TP53INP1 的表達情況（A）在乳腺癌組織中TP53INP1 陽性表達，主要定位在胞漿或胞核（B）相應(yīng)的癌旁組織中 TP53INP1的陽性表達（C）TP53INP1 的陰性表達。表 1.1 TP53INP1 在乳腺癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中表達相關(guān)分析*差異具有統(tǒng)計學(xué)意義1.2.2 人乳腺癌組織中 TP53INP1 表達情況及于臨床病理參數(shù)，臨床預(yù)后之間的關(guān)系cancer tissueN=73pericarcinous tissueN=73χ2 PTP53INP1Negative 37 254.037 0.045*Positive 36 48

1.2 TP53INP1（+）與 TP53INP1（-）生存分析曲織中 TP53INP1 表達與 Snail 和 HIF-1α表達的關(guān)系 Snail 作為 EMT 的轉(zhuǎn)錄因子，而 HIF-1α是形成 E子，分析 TP53INP1 與 Snail，HIF-1α之間的關(guān)系 對上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成擬態(tài)影響提供更有 1.3 所示定位于胞漿和胞核中 Snail，定位于胞核-1α陽性表達患者占 TP53INP1 陰性表達組中 72%性相關(guān)關(guān)系（26/36 P=0.044），同樣的 TP53INP1.001）。我們還通過 Pearson 相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP5（r=-0.0293，P=0.003）。 TP53INP1 在乳腺癌中與 HIF-1α和 Snail 蛋白的相TP53INP1χ2 P-（%） +（%）

腺癌組織中 Snail 與 HIF-1α的免疫組織化學(xué)染色。在 TP和 HIF-1α呈陽性表達，TP53INP1 陽性組中 Snail 和 HIFnail 陽性表達位于胞漿和胞核中，HIF-1α陽性表達在胞乳腺癌組織中 TP53INP1 與 HIF-1α相關(guān)分析（r=-0.029組織中 TP53INP1 與 VM 的關(guān)系

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Binhua P.Zhou;;Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer progression and metastasis[J];癌癥;2011年09期

本文編號：2768211