【摘要】：目的:探討非甾體抗炎藥塞來(lái)昔布作用于結(jié)腸癌干細(xì)胞,通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路中β-catenin從而對(duì)其“干性”、分化程度的影響及可能存在的機(jī)制。方法:1.流式分選HT-29和SW480得到CD133~+/CD44~+雙標(biāo)的的結(jié)腸癌干細(xì)胞后進(jìn)行懸浮培養(yǎng);2.采用CKK8法檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的影響,并且選取合適的藥物濃度梯度。3.TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)塞來(lái)昔布干預(yù)后對(duì)CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞晚期凋亡的影響;4.塞來(lái)昔布干預(yù)CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞后,觀察其對(duì)細(xì)胞成球能力的影響。5.塞來(lái)昔布干預(yù)CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞后,觀察其對(duì)克隆形成能力的影響。6.用塞來(lái)昔布處理CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞后,用PCR法檢測(cè)重要干性標(biāo)志物L(fēng)gr5、Sox2和分化標(biāo)志物Vilin、Muc2以及β-catenin在mRNA水平的表達(dá)7.進(jìn)一步用Western-Blot檢測(cè)Lgr5、Muc2以及β-catenin、磷酸化的β-catenin蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果:(1)CCK-8結(jié)果顯示不同濃度的塞來(lái)昔布(5、10、20、40μmol/L)作用于一定時(shí)間(24h、48h、72h)后,與對(duì)照組相比,塞來(lái)昔布呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖(p0.05)。(2)TUNEL實(shí)驗(yàn)中顯示在20μmol/L塞來(lái)昔布作用于CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞可誘導(dǎo)其晚期凋亡。(3)成球?qū)嶒?yàn)顯示,20μmol/L塞來(lái)昔布作用CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞10天后,CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞成球數(shù)量和體積明顯地降低(p0.05)。(4)克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,用20μmol/L塞來(lái)昔布處理后14天后,CD133~+/CD44~+結(jié)腸癌干細(xì)胞克隆形成能力明顯地降低(p0.05)。(5)PCR法檢測(cè)干性指標(biāo)Lgr5、Sox2在mRNA水平的表達(dá)下調(diào),分化指標(biāo)Muc2、Villin在mRNA水平的表達(dá)上調(diào),以及β-catenin在mRNA水平的表達(dá)下調(diào)、磷酸化的β-catenin在mRNA水平的表達(dá)上調(diào)(p0.05)。(6)Western-Blot發(fā)現(xiàn)干性指標(biāo)Lgr5蛋白水平的表達(dá)下調(diào),分化指標(biāo)Muc2在蛋白水平的表達(dá)上調(diào),以及β-catenin在蛋白水平的表達(dá)下調(diào)、磷酸化的β-catenin在蛋白水平的表達(dá)上調(diào)(p0.05)結(jié)論:(1)塞來(lái)昔布能夠有效地抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡。(2)塞來(lái)昔布處理后的結(jié)腸癌干細(xì)胞,可降低Wnt信號(hào)通路中β-catenin表達(dá)、增加磷酸化β-catenin的表達(dá),其下游靶標(biāo)干性標(biāo)志物L(fēng)gr5和Sox2的表達(dá)均降低,在行為學(xué)行上其成球能力和克隆形成能力也明顯的降低,說(shuō)明塞來(lái)昔布可在一定程度上抑制結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞的“干性”。(3)塞來(lái)昔布作用結(jié)腸癌干細(xì)胞后,可使其分化指標(biāo)Muc2和Villin的表達(dá)增加,說(shuō)明塞來(lái)昔布具有促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞向成熟分化的能力。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.35
【圖文】：

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 朱生琳2 結(jié)果2.1 流式分選 CD133+/CD44+獲得結(jié)腸癌干細(xì)胞通過(guò)流式分選儀雙標(biāo)抗體 CD133、CD44 分選出目的細(xì)胞 CD133+/CD44+HT-29 和CD133+/CD44+SW480 結(jié)腸癌干細(xì)胞,根據(jù) CD133、CD44 抗體結(jié)合結(jié)腸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物的原理將其標(biāo)記流式分選儀篩選出來(lái)（圖 1）。

細(xì)胞增殖的影響CCK-8 是測(cè)定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高敏度、無(wú)放射性的比色檢測(cè)法。CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性試驗(yàn)的靈敏度比 MTT、XTT、及 MTS 更高，數(shù)據(jù)可靠，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性。CCK8 中含有 WST-8,是一種更新的水溶性四唑鹽。水溶性四唑鹽在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚，細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈良好線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)用 CCK細(xì)胞增殖技術(shù)檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的影響，CCK-8 結(jié)果顯示：2,5-Dimethyl-celecoxib 分別作用結(jié)腸癌干細(xì)胞 HT-29、SW480 24h、48h、72h 后2,5-Dimethyl-celecoxib 濃度從 5μmol/L 到 40μmol/L,隨著濃度的增加，其對(duì)結(jié)癌干細(xì)胞的增殖抑制作用越明顯（p＜0.05）。因此，2,5—Dimethyl-celecoxib 呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性地抑制結(jié)腸癌干的增殖（圖 2，表 1，表 2）。

圖 3：TUNEL 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 2,5—Dimethyl-celecoxib 對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞 SW480 和 HT-29 晚期凋亡的影響。2.4 塞來(lái)昔布對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞成球能力的影響腫瘤干細(xì)胞成球能力是鑒定腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)重要方法，并且可以判斷其單個(gè)細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞在適宜條件中的自我更新的能力，一般用細(xì)胞球形成效率表示。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) 20μmol/L 塞來(lái)昔布干預(yù)結(jié)腸癌干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其成球能力體積和數(shù)量上顯著降低(圖 4,表 3）

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