發(fā)布時間：2020-07-23 11:03

【摘要】：目的間充質(zhì)干細胞在皮膚及附屬器創(chuàng)傷后的修復(fù)再生過程中發(fā)揮重要作用。然而,其作用機制尚未完全闡明。因此,深入探究創(chuàng)面對募集間充質(zhì)干細胞并誘導(dǎo)其初步分化的影響,歸巢間充質(zhì)干細胞的旁分泌效應(yīng)對創(chuàng)面愈合的作用,以及間充質(zhì)干細胞重編程為汗腺樣細胞的途徑和機制,有利于引導(dǎo)皮膚創(chuàng)傷部位多組織同時有序的修復(fù)再生。為實現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能兼具的完美修復(fù)提供實驗依據(jù)。方法1.對空白組和創(chuàng)面組小鼠分別回輸以紅色熒光探針標(biāo)記間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)后,免疫熒光及流式細胞術(shù)分別檢測MSCs的歸巢情況。同時,不同周齡小鼠在形成全層皮膚缺失創(chuàng)面后2天,分別分離骨髓及外周血來源的MSCs,流式細胞術(shù)檢測CD29,CD44,CD90和CD105的表達以評估其干性,檢測OPN,Nestin,Myosin和CK19的表達以明確其分化方向。2.微珠法檢測MSCs培養(yǎng)上清中的主要活性分子,流式細胞術(shù)檢測MSCs 培養(yǎng)上清對人表皮細胞(Human immortalized keratinocyte,HaCaT)的活性,細胞周期,凋亡的影響。劃痕實驗,RT-qPCR,Western blot,免疫熒光檢測MSCs培養(yǎng)上清對HaCaT細胞EMT樣改變的影響。建立小鼠全層皮膚缺失創(chuàng)面模型,檢測MSCs培養(yǎng)上清在體內(nèi)對愈合速度的影響。3.利用CRISPR/dCas9技術(shù),預(yù)測人外胚層發(fā)育不良蛋白(ectodysplasin,EDA)啟動子序列,包裝含有sgRNA的慢病毒并感染MSCs細胞,RT-qPCR,Western blot,免疫熒光檢測汗腺細胞相關(guān)標(biāo)志物的表達情況,透射電鏡檢測細胞超微結(jié)構(gòu)。Western blot及免疫熒光檢測相關(guān)信號分子活性及細胞內(nèi)定位。制備小鼠腳掌燙傷模型,檢測移植dCas9-E-MSC后小鼠腳掌的發(fā)汗能力。結(jié)果1.創(chuàng)面組織切片免疫熒光可見紅色熒光信號,流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也證實創(chuàng)面組織中標(biāo)記的MSCs數(shù)量升高。同時,在不同周齡小鼠的創(chuàng)面模型中,骨髓及外周血中MSCs表面標(biāo)志物與空白組相比表達CD29,CD44,CD90,CD105變化不大,分化標(biāo)志物中,OPN,Myosin表達趨勢與空白組基本一致,而Nestin和CK19較空白對照組升高明顯。2.微珠實驗證實TGF-β是MSCs培養(yǎng)上清中的主要活性分子。MSCs培養(yǎng)上清能促進HaCaT細胞增殖和遷移,RT-qPCR,Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示MSCs培養(yǎng)上清能誘導(dǎo)HaCaT細胞發(fā)生EMT樣改變,而TGF-β特異性抑制劑SB-431542能夠逆轉(zhuǎn)此種變化。動物實驗結(jié)果顯示注射MSCs培養(yǎng)上清能夠加速皮膚創(chuàng)面愈合。3.成功預(yù)測EDA基因啟動子序列并構(gòu)建含有sgRNA序列的慢病毒,篩選得到的陽性細胞株經(jīng)RT-qPCR,Western blot和免疫熒光實驗檢測證實CEA,CK19等汗腺標(biāo)志物陽性,透射電鏡顯示其具有絨毛結(jié)構(gòu)。小鼠腳掌燙傷模型證實該細胞株具備發(fā)汗能力。RT-qPCR,Western blot和免疫熒光顯示EDA表達可激活NF-κB,進而促進Shh及CyclinD1在細胞中的表達。結(jié)論皮膚創(chuàng)傷發(fā)生后,創(chuàng)面組織能募集MSCs經(jīng)外周循環(huán)發(fā)生歸巢,并能夠誘導(dǎo)MSCs向成神經(jīng)和成皮膚方向初步分化。歸巢至創(chuàng)面組織的MSCs可通過旁分泌效應(yīng)調(diào)節(jié)局部微環(huán)境,其分泌的主要活性分子TGF-β通過激活TGF-β/Smad信號通路加速表皮細胞的EMT過程,從而促進創(chuàng)面愈合。同時,利用CRISPR/dCas9技術(shù)能夠直接重編程MSCs為汗腺樣細胞,解決創(chuàng)面愈合后局部汗腺再生的難題,為探索創(chuàng)傷后多組織同步再生,實現(xiàn)完美修復(fù)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R641
【圖文】：

結(jié)果逡逑資料逡逑ｕｔｏｆｆ值的確定逡逑織高浸潤中性粒細胞（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ；邋ＴＡＮｓ）及中性值（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ邋ｒａｔｉｏ；邋ＮＬＲ）是近年來發(fā)現(xiàn)的與肝癌因素［５，１３］，并對與腫瘤X椫場⒆葡喙氐牡鶻諦裕韻赴哂心技馱鲆嚀穎芎湍褪苤蟹⒒又匾饔茫郟擔(dān)保常藎暈頤且裕危蹋義澹茫酰簦錚媯娼韁底骼氛鏤蝸赴┠扇氡狙芯康娜胱楸曜�。辶x細偉┗頰哂耄保埃怖】堤寮烊巳海危蹋易觶遙希們叻治觶裕伲纖雜Φ膩澹危蹋義遄魑澹茫酰簦錚媯駑澹劍保罰瑰澹ǎ伲錚酰洌澹鑠澹椋睿洌澹澹藉澹櫻澹睿螅椋簦椋觶椋簦濉澹櫻穡保�。辶x希保埃板五危峰巍澹櫻澹睿螅椋簦椋觶椋簦ュ義

本文編號：2767238