【摘要】：目的間充質(zhì)干細(xì)胞在皮膚及附屬器創(chuàng)傷后的修復(fù)再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而,其作用機(jī)制尚未完全闡明。因此,深入探究創(chuàng)面對(duì)募集間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)其初步分化的影響,歸巢間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)對(duì)創(chuàng)面愈合的作用,以及間充質(zhì)干細(xì)胞重編程為汗腺樣細(xì)胞的途徑和機(jī)制,有利于引導(dǎo)皮膚創(chuàng)傷部位多組織同時(shí)有序的修復(fù)再生。為實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能兼具的完美修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.對(duì)空白組和創(chuàng)面組小鼠分別回輸以紅色熒光探針標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)后,免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)MSCs的歸巢情況。同時(shí),不同周齡小鼠在形成全層皮膚缺失創(chuàng)面后2天,分別分離骨髓及外周血來(lái)源的MSCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29,CD44,CD90和CD105的表達(dá)以評(píng)估其干性,檢測(cè)OPN,Nestin,Myosin和CK19的表達(dá)以明確其分化方向。2.微珠法檢測(cè)MSCs培養(yǎng)上清中的主要活性分子,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs 培養(yǎng)上清對(duì)人表皮細(xì)胞(Human immortalized keratinocyte,HaCaT)的活性,細(xì)胞周期,凋亡的影響。劃痕實(shí)驗(yàn),RT-qPCR,Western blot,免疫熒光檢測(cè)MSCs培養(yǎng)上清對(duì)HaCaT細(xì)胞EMT樣改變的影響。建立小鼠全層皮膚缺失創(chuàng)面模型,檢測(cè)MSCs培養(yǎng)上清在體內(nèi)對(duì)愈合速度的影響。3.利用CRISPR/dCas9技術(shù),預(yù)測(cè)人外胚層發(fā)育不良蛋白(ectodysplasin,EDA)啟動(dòng)子序列,包裝含有sgRNA的慢病毒并感染MSCs細(xì)胞,RT-qPCR,Western blot,免疫熒光檢測(cè)汗腺細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況,透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。Western blot及免疫熒光檢測(cè)相關(guān)信號(hào)分子活性及細(xì)胞內(nèi)定位。制備小鼠腳掌燙傷模型,檢測(cè)移植dCas9-E-MSC后小鼠腳掌的發(fā)汗能力。結(jié)果1.創(chuàng)面組織切片免疫熒光可見(jiàn)紅色熒光信號(hào),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)創(chuàng)面組織中標(biāo)記的MSCs數(shù)量升高。同時(shí),在不同周齡小鼠的創(chuàng)面模型中,骨髓及外周血中MSCs表面標(biāo)志物與空白組相比表達(dá)CD29,CD44,CD90,CD105變化不大,分化標(biāo)志物中,OPN,Myosin表達(dá)趨勢(shì)與空白組基本一致,而Nestin和CK19較空白對(duì)照組升高明顯。2.微珠實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF-β是MSCs培養(yǎng)上清中的主要活性分子。MSCs培養(yǎng)上清能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖和遷移,RT-qPCR,Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示MSCs培養(yǎng)上清能誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變,而TGF-β特異性抑制劑SB-431542能夠逆轉(zhuǎn)此種變化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注射MSCs培養(yǎng)上清能夠加速皮膚創(chuàng)面愈合。3.成功預(yù)測(cè)EDA基因啟動(dòng)子序列并構(gòu)建含有sgRNA序列的慢病毒,篩選得到的陽(yáng)性細(xì)胞株經(jīng)RT-qPCR,Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)CEA,CK19等汗腺標(biāo)志物陽(yáng)性,透射電鏡顯示其具有絨毛結(jié)構(gòu)。小鼠腳掌燙傷模型證實(shí)該細(xì)胞株具備發(fā)汗能力。RT-qPCR,Western blot和免疫熒光顯示EDA表達(dá)可激活NF-κB,進(jìn)而促進(jìn)Shh及CyclinD1在細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)論皮膚創(chuàng)傷發(fā)生后,創(chuàng)面組織能募集MSCs經(jīng)外周循環(huán)發(fā)生歸巢,并能夠誘導(dǎo)MSCs向成神經(jīng)和成皮膚方向初步分化。歸巢至創(chuàng)面組織的MSCs可通過(guò)旁分泌效應(yīng)調(diào)節(jié)局部微環(huán)境,其分泌的主要活性分子TGF-β通過(guò)激活TGF-β/Smad信號(hào)通路加速表皮細(xì)胞的EMT過(guò)程,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。同時(shí),利用CRISPR/dCas9技術(shù)能夠直接重編程MSCs為汗腺樣細(xì)胞,解決創(chuàng)面愈合后局部汗腺再生的難題,為探索創(chuàng)傷后多組織同步再生,實(shí)現(xiàn)完美修復(fù)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R641
【圖文】：

結(jié)果逡逑資料逡逑ｕｔｏｆｆ值的確定逡逑織高浸潤(rùn)中性粒細(xì)胞（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ；邋ＴＡＮｓ）及中性值（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ邋ｒａｔｉｏ；邋ＮＬＲ）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與肝癌因素［５，１３］，并對(duì)與腫瘤X椫場(chǎng)⒆葡喙氐牡鶻諦裕韻赴哂心技馱鲆嚀穎芎湍褪苤蟹⒒又匾饔茫郟擔(dān)保常藎暈頤且裕危蹋義澹茫酰簦錚媯娼韁底骼氛鏤蝸赴┠扇氡狙芯康娜胱楸曜�。辶x細(xì)偉┗頰哂耄保埃怖】堤寮烊巳海危蹋易觶遙希們叻治觶裕伲纖雜Φ膩澹危蹋義遄魑澹茫酰簦錚媯駑澹劍保罰瑰澹ǎ伲錚酰洌澹鑠澹椋睿洌澹澹藉澹櫻澹睿螅椋簦椋觶椋簦濉澹櫻穡保ｅ義希保埃板五危峰巍澹櫻澹睿螅椋簦椋觶椋簦ュ義

本文編號(hào)：2767238