【摘要】：結(jié)腸癌是一種臨床常見惡性腫瘤,在女性及男性腫瘤發(fā)病率中分別位居二、三位,在西方發(fā)達國家,隨著早期人群干預的開展,結(jié)腸癌發(fā)病率已趨于穩(wěn)定或下降趨勢,但在發(fā)展中國家仍不斷上升。隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、居民生活方式轉(zhuǎn)變,以及人口老齡化的加劇,在我國,目前結(jié)腸癌已經(jīng)成為威脅人民生活健康的重要疾病之一,顯示逐年增長趨勢,且發(fā)病年齡有所提前。在過去幾年,結(jié)腸癌的治療已取得較快的進展,但是,由于發(fā)病的隱匿性及癥狀的不典型,導致很多結(jié)腸癌患者就診時已達中晚期,死亡率一直居高不下,其原因主要為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多種基因的改變,因此,如何篩選結(jié)腸癌預后標志物并進行針對性干預則成為當務之急。三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATPasefamilyAAAdomain-containingprotein2,ATAD2)參與調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄,進而調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導,其表達異常通常與惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。有研究表明,與癌旁組織相比,ATAD2在結(jié)腸癌組織中呈現(xiàn)異常高表達;而且RNA干擾技術(shù)(RNAi)介導的ATAD2下調(diào)已被證實可抑制多種癌細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。但對于ATAD2在結(jié)腸癌進展中的作用尚不明確。為研究ATAD2基因在結(jié)腸癌發(fā)生及進展中的作用,本研究計劃通過RNA干擾技術(shù)沉默人結(jié)腸癌細胞Caco-2與SW480中ATAD2的表達,探討ATAD2表達下調(diào)對結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲遷移能力以及體內(nèi)腫瘤形成能力的影響及作用機制,為結(jié)腸癌發(fā)病機制及腫瘤基因治療研究提供治療靶點以及理論依據(jù)。我們的研究內(nèi)容主要由以下幾個方面:一、ATAD2基因沉默對結(jié)腸癌細胞增殖及細胞周期的影響1、ATAD2shRNA重組表達載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank登錄ATAD2基因(XM_011516994)保守序列以及參考Ambin公司網(wǎng)站提供的RNAi設計軟件確定ATAD2靶位點,并設計合成ATAD2-shRNA(shATAD2)寡核苷酸,與酶切后載體pRNA-H1.1質(zhì)粒連接重組,測序鑒定。2、ATAD2基因沉默穩(wěn)定克隆的篩選與鑒定利用脂質(zhì)體法將pRNA-H1.1-shATAD2及對照shCtr質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞Caco-2及SW480,經(jīng)G418抗性篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,熒光定量PCR及WesternBlot分別檢測ATAD2mRNA及蛋白表達,鑒定ATAD2基因沉默穩(wěn)定克隆篩選成功。3、ATAD2基因沉默對細胞增殖及細胞周期的影響分別利用CCK8及平板克隆實驗檢測細胞增殖及克隆形成能力,結(jié)果顯示:與未轉(zhuǎn)染細胞Caco-2-wt、SW480-wt及轉(zhuǎn)染對照組Caco-2-shCtr、SW480-shCtr相比較,ATAD2基因沉默組Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2細胞中細胞增殖能力均顯著下調(diào),克隆形成能力收到抑制(P0.05);流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化情況,實驗結(jié)果顯示:ATAD2基因沉默組Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2組細胞G1期顯著增加,S期所占比例減少,提示ATAD2基因沉默使結(jié)腸癌細胞周期阻滯于G1期。4、ATAD2基因沉默對細胞增殖及細胞周期影響的相關(guān)機制利用熒光定量PCR及WesternBlot分別檢測ATAD2基因沉默對細胞增殖、周期相關(guān)基因及蛋白表達的影響,實驗結(jié)果顯示ATAD2基因沉默組Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2組細胞增殖相關(guān)因子PCNA、C-myc、Ki67等mRNA及蛋白表達水平均下調(diào),Akt磷酸化程度降低,信號通路活性受到抑制;細胞周期相關(guān)因子CyclinD1、CyclinE1、CDK2基因mRNA表達水平顯著下調(diào),抑癌基因p21mRNA表達水平顯著上升,提示ATAD2基因沉默能夠抑制細胞增殖相關(guān)基因的表達以及相關(guān)信號通路的活化。二、ATAD2基因沉默對結(jié)腸癌細胞侵襲遷移能力的影響1、ATAD2基因沉默抑制結(jié)腸癌細胞遷移及侵襲采用細胞劃痕及Transwell小室分別檢測ATAD2基因沉默后結(jié)腸癌細胞的遷移及侵襲能力變化,結(jié)果顯示:與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染對照組相比,ATAD2基因沉默組Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2劃痕愈合能力以及侵襲能力均顯著下降,提示ATAD2基因沉默能夠抑制結(jié)腸癌細胞侵襲及遷移。2、ATAD2基因沉默對結(jié)腸癌細胞EMT進程的影響及機制通過熒光定量PCR、WesternBlot以及免疫熒光分別檢測EMT相關(guān)指標變化情況,分析ATAD2基因沉默對結(jié)腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的影響,結(jié)果顯示,與對照組相比,ATAD2基因沉默組Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2細胞間質(zhì)細胞標志物及細胞轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白Vimentin、Slug、Snail等指標下調(diào),上皮細胞標志物E-cadherin表達水平顯著上升(P0.01),提示ATAD2基因沉默可能抑制結(jié)腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換等生物學行為,進而抑制了腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。3、ATAD2基因沉默影響細胞侵襲的可能機制為探索ATAD2基因沉默對結(jié)腸癌細胞侵襲能力影響的分子機制,采用WesternBlot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9以及MMP13蛋白表達水平,并通過明膠酶譜對MMP2、MMP9進行活性檢測,實驗結(jié)果驗證了ATAD2基因沉默能夠降低MMP2、MMP9以及MMP13蛋白表達水平,并抑制MMP2、MMP9活性。三、ATAD2沉默對結(jié)腸癌體內(nèi)移植瘤形成的影響1、建立裸鼠移植瘤模型將SW480-shATAD2以及對照SW480-shCtr細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,分別向裸鼠腋窩皮下注射1×107/0.2ml腫瘤細胞,自接種之日起每天觀察裸鼠狀態(tài)、成瘤時間及瘤體生長情況。2、大體觀察移植瘤形成情況在接種細胞后9天左右兩組均開始出現(xiàn)可觸及腫瘤硬結(jié)。與對照(shCtr)組相比,沉默(shATAD2)組腫瘤體積增長較為緩慢,四周后處死小鼠,取出瘤體進行稱量,沉默(shATAD2)組瘤體重量顯著降低。3、移植瘤生長曲線繪制自觀察到裸鼠成瘤起,每三天用游標卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的長徑和短徑,計算腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線,結(jié)果顯示:對照(shCtr)組裸鼠體內(nèi)瘤組織增長迅速,而與對照(shCtr)組相比,沉默(shATAD2)組腫瘤體積增長較為緩慢,提示ATAD2基因沉默可能抑制結(jié)腸癌細胞在體內(nèi)移植瘤的形成。4、腫瘤增殖相關(guān)因子檢測提取兩組腫瘤組織總RNA,通過熒光定量PCR檢測瘤體內(nèi)ATAD2基因及增殖相關(guān)基因PCNA、C-myc、Ki67mRNA表達水平,與shCtr組相比,shATAD2組細胞中ATAD2、PCNA、C-myc、Ki67表達水平顯著下調(diào)(P0.01);免疫組化檢測兩組瘤組織中ATAD2基因及增殖相關(guān)基因Ki67mRNA原位表達情況,結(jié)果表明,與shCtr組相比,shATAD2組腫瘤組織中ATAD2、Ki67表達水平顯著下調(diào)。結(jié)論:本論文通過細胞水平及動物體內(nèi)水平研究驗證發(fā)現(xiàn),ATAD2基因沉默能夠抑制結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲及遷移,提示ATAD2表達在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,本研究為結(jié)腸癌基因治療提供新的候選靶點及理論依據(jù)。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
【圖文】：

.1 熒光定量 PCR 檢測 pRNA-H1.1- shATAD2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌胞基因沉默效果：Caco-2 細胞組；B：SW480 細胞組；*P＜0.05 vs wt 組、** vs wt 組）2.1 Real-time PCR was performed to measure the expression levelsD2toevaluatethetransfectionefficiencyofATAD2shRNA.：Caco-2 cell lines group；B：SW480 cell lines group；*P＜0.0roup、**P＜0.01 vs wt group）2 Western Blot 檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pRNA-H1.1- shATAD2 對結(jié)腸 ATAD2 蛋白表達的影響

.2 WesternBlot檢測pRNA-H1.1-shATAD2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細蛋白沉默效果（A、C：Caco-2 細胞組 ATAD2 蛋白表達情況；B、D：SW組ATAD2蛋白表達情況；*P＜0.05vswt 組、**P＜0.01vswt組2.2 Western Blot was performed to measure the expression leveD2toevaluatethetransfectionefficiencyofATAD2shRNA.（A：The ATAD2 protein expression in Caco-2 cell lines；B：D2 protein expression in SW480 cell lines；*P＜0.05 vs wt grou＜0.01 vs wt group）

第 2 章 ATAD2 基因沉默對結(jié)腸癌細胞增殖及細胞周期的影響2.3.3 CCK8 法分析 pRNA-H1.1- shATAD2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響為分析 ATAD2 基因沉默對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響，將各組細胞接種 96 孔板，CCK8 法分別檢測接種24h、48h、72h、96h 后細胞生長情況，結(jié)果如圖2.3所示：在細胞接種后的每個時間點，與未轉(zhuǎn)染細胞Caco-2-wt、SW480-wt 相比，轉(zhuǎn)染對照組Caco-2-shCtr、SW480-shCtr中細胞增殖能力變化不明顯；而ATAD2 基因沉默組Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2細胞中細胞增殖能力均顯著下調(diào)（P＜0.05）。

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本文編號：2767155