【摘要】：研究背景:表觀遺傳組蛋白修飾在腫瘤發(fā)生以及在調控機體免疫系統(tǒng)上發(fā)揮著重要的作用。有研究表明在腫瘤發(fā)生及進展過程中常常會出現表觀調控失常。值得注意的是,果蠅zeste基因增強子的人類同源物2(EZH2)是表觀遺傳調控因子多屬抑制復合體2的催化亞基,可以催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化并導致基因沉默�，F有大量研究表明EZH2在肺癌,結腸癌,胰腺癌,前列腺癌等腫瘤中高表達,同時EZH2異常高表達也與臨床不良預后成明顯的相關性。更為重要的是,EZH2參與調控腫瘤細胞的生長與轉移。因此抑制EZH2的活性可作為一個潛在的抗癌癥治療方式。到目前為止,已開發(fā)出多種高效并且特異性強的EZH2抑制劑,包括GSK126,EPZ-6438等,這兩類藥物已經進入到臨床實驗階段中并用于治療進展性的實體腫瘤以及B淋巴細胞瘤。腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤情況在一定程度上可以影響腫瘤的轉歸。大量的研究表明研究抗腫瘤藥物對腫瘤微環(huán)境的影響可以更好地評估其抗腫瘤療效,并開發(fā)出更有效的治療策略。GSK126作為一種抗腫瘤的藥物已經進入到臨床實驗階段,然而其療效僅僅在免疫缺陷的小鼠體內進行了證實,并沒有考慮到藥物對腫瘤微環(huán)境的影響。但是EZH2參與調控多種免疫細胞的生物學行為,EZH2抑制后可能會影響免疫細胞的功能從而改變其腫瘤免疫微環(huán)境狀態(tài)。因此,我們推測EZH2抑制以后可能會降低免疫細胞的活性從而影響其抗腫瘤效應�；诖�,探索EZH2抑制劑在免疫完全小鼠抗腫瘤效果以及其對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的影響可能會為臨床上增強EZH2抑制劑的療效提供理論基礎。方法:1.研究GSK126在免疫完全以及免疫缺陷小鼠中的抗腫瘤療效。1.1 C57BL/6小鼠皮下接種LLC,之后這些小鼠接受GSK126或者生理鹽水注射治療。1.2裸鼠皮下接種LLC,之后這些小鼠接受GSK126或者生理鹽水注射治療。1.3 C57BL/6小鼠皮下接種MC38,之后這些小鼠接受GSK126或者生理鹽水注射治療。1.4裸鼠皮下接種MC38,之后這些小鼠接受GSK126或者生理鹽水注射治療。2.研究GSK126對適應性免疫細胞的影響。2.1使用流式細胞術檢測腫瘤組織中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。2.2使用流式細胞術檢測腫瘤組織中Ki67~+細胞在CD4~+T細胞和CD8~+T細胞中的比例。2.3使用流式細胞術檢測腫瘤組織中IFN-γ~+細胞在CD8~+T細胞中的比例。2.4使用流式細胞術檢測腫瘤組織中Gzms-B~+細胞在CD8~+T細胞中的比例。2.5使用流式細胞術檢測血液中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。2.6使用流式細胞術檢測血液中IFN-γ~+細胞在CD8~+T細胞中的比例。2.7使用流式細胞術檢測脾臟中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。2.8使用流式細胞術檢測脾臟中IFN-γ~+細胞在CD8~+T細胞中的比例。3.研究GSK126能否通過改變腫瘤微環(huán)境從而抑制CD8~+T細胞的活性。3.1 C57BL/6小鼠皮下接種1X10~6MC38-OVA細胞。GSK126給予4天。7天后,使用磁珠分選出2 X10~6的OT1小鼠脾臟中的CD45.1~+CD8~+T細胞回輸至荷瘤小鼠體內。3.2使用流式細胞術檢測脾臟中CD45.1~+細胞在CD8~+T細胞中的比例。3.3使用流式細胞術檢測脾臟中IFN-γ~+細胞在CD45.1~+CD8~+T細胞(初始CD8~+T細胞)中的比例(使用佛波醇酯+離子霉素或者OVA刺激)。3.4使用流式細胞術檢測脾臟中IFN-γ~+細胞在CD45.1~+CD8~+T細胞(活化后的CD8~+T細胞)中的比例(使用佛波醇酯+離子霉素或者OVA刺激)。3.5研究GSK126治療后哪一種免疫抑制細胞抑制了CD8~+T細胞的活性。3.6使用流式細胞術檢測腫瘤組織中調節(jié)性T細胞的比例。3.7使用流式細胞術檢測腫瘤組織中腫瘤相關巨噬細胞的比例。3.8使用流式細胞術檢測腫瘤組織中樹突狀細胞的比例。4.使用流式細胞術檢測腫瘤組織中骨髓來源抑制細胞(MDSC)的比例。4.1使用流式細胞術檢測腫瘤組織中粒系來源MDSC和單核系來源MDSC的比例。4.2分選出control組以及GSK126處理組腫瘤組織中的MDSC,與CD8~+T細胞進行共培養(yǎng),檢測其對CD8~+T細胞增殖的抑制能力。4.3使用流式細胞術檢測腫瘤組織中ROS~+細胞在MDSC中的比例。4.4使用熒光定量PCR檢測control組以及GSK126處理組MDSC中Arg1和iNOS的表達情況。5.研究GSK126介導的MDSC增多是否影響了其抗腫瘤效應。5.1 C57BL/6小鼠皮下接種1X10~6LLC細胞,GSK126一周給與5次,Gr-1中和抗體一周給與兩次。腫瘤體積每兩天檢測一次。5.2檢測血液中Gr-1中和抗體清除MDSC的效率。5.3使用流式細胞術檢測腫瘤組織中MDSC的比例。5.4使用流式細胞術檢測腫瘤組織中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。5.5使用流式細胞術檢測腫瘤組織中IFN-γ~+細胞在CD8~+T細胞中的比例。5.6使用Tunel法檢測腫瘤組織中腫瘤細胞的凋亡情況。6.研究吉西他濱/5FU的與GSK126的聯合治療策略是否可以提高GSK126的抗腫瘤效果。6.1 C57BL/6小鼠皮下接種1X10~6LLC細胞,GSK126一周給與5次吉西他濱/5FU一周給與一次。腫瘤體積每兩天檢測一次。6.2使用流式細胞術檢測腫瘤組織中MDSC的比例。6.3使用流式細胞術檢測腫瘤組織中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。7.研究GSK126促進MDSC增多的原因。7.1使用Brdu法檢測MDSC的增殖能力。7.2使用流式細胞術檢測骨髓,血液和脾臟中MDSC的比例。7.3使用qPCR和蛋白印跡實驗檢測HPC,MDSC和巨噬細胞中EZH2的表達。7.4使用免疫印跡法檢測GSK126處理后H3k27me3的表達情況。7.5使用流式細胞術檢測GSK126處理后,HPC往MDSC的分化能力。結果:1.GSK126并不能有效抑制免疫功能完全的荷瘤小鼠腫瘤的生長。1.1在LLC皮下移植瘤模型當中,GSK126能夠明顯抑制免疫缺陷小鼠體內腫瘤的生長。1.2在LLC皮下移植瘤模型當中,GSK126不能抑制免疫功能完全小鼠體內腫瘤的生長。1.3在MC38皮下移植瘤模型當中,GSK126能夠明顯抑制免疫缺陷小鼠體內腫瘤的生長。1.4在MC38皮下移植瘤模型當中,GSK126不能抑制免疫功能完全小鼠體內腫瘤的生長。2.GSK126減弱了抗腫瘤適應性免疫應答。2.1使用GSK126能夠減少腫瘤組織中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。2.2使用GSK126能夠減少腫瘤組織中CD8~+T細胞中的Ki67~+細胞的比例。2.3使用GSK126能夠減少腫瘤組織中CD8~+T細胞中的IFN-γ~+細胞的比例。2.4使用GSK126不會改變腫瘤組織中CD8~+T細胞中的Gzms-B~+細胞的比例。2.5使用GSK126能夠減少血液中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。2.6使用GSK126能夠減少血液中CD8~+T細胞中的IFN-γ~+細胞的比例。2.7使用GSK126能夠減少脾臟中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。2.8使用GSK126能夠減少脾臟中CD8~+T細胞中的IFN-γ~+細胞的比例。3.GSK126通過重塑腫瘤微環(huán)境進而影響CD8~+T細胞的數量與功能。3.1使用GSK126能夠減少CD8~+T細胞中的CD45.1~+細胞的比例。3.2使用GSK126能夠減少CD45.1~+CD8~+T細胞中(初始T細胞)的IFN-γ~+細胞的比例。3.3使用GSK126能夠減少CD45.1~+CD8~+T細胞中(活化T細胞)的IFN-γ~+細胞的比例。4.GSK126促進腫瘤組織中MDSC的擴增。4.1使用GSK126不會影響調節(jié)性T細胞。4.2使用GSK126不會影響腫瘤相關巨噬細胞。4.3使用GSK126不會影響樹突狀細胞。4.4 GSK126能夠顯著增加腫瘤組織中MDSC的比例。4.5 GSK126能夠顯著增加粒系來源的MDSC以及單核系來源MDSC的比例。4.6經GSK126治療后的荷瘤小鼠腫瘤組織中的MDSC,相較于對照組腫瘤組織中的MDSC,都具有相同的對T細胞的抑制能力。4.7 GSK126治療后并不會改變MDSC上ROS,Arg1,iNOS等效應分子的表達。5.清除MDSC后能夠恢復GSK126的抗腫瘤效應。5.1 MDSC清除后能夠腫瘤體積明顯縮小。5.2注射Gr-1清除抗體能夠有效地清除血液中的MDSC。5.3注射Gr-1清除抗體能夠顯著減少腫瘤組織中的MDSC比例。5.4注射Gr-1清除抗體能夠顯著增加腫瘤組織中的CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例。5.5注射Gr-1清除抗體能夠顯著增加腫瘤組織中CD8~+T細胞中的IFN-γ~+細胞的比例。5.6聯合使用GSK126和Gr-1中和抗體能夠增加腫瘤細胞的凋亡。6.臨床化療藥物能夠提高GSK126的抗腫瘤效應。6.1吉西他濱或5Fu能夠顯著提高GSK126的抗腫瘤效果。6.2在聯合治療組中,腫瘤組織中的MDSC比例明顯下降。6.3在聯合治療組中,腫瘤組織中的CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的比例明顯增加。7.GSK126促進造血前體細胞分化為MDSC7.1 GSK126不能促進MDSC的增殖。7.2 GSK126不會改變腫瘤組織中趨化因子的表達。7.3 GSK126能夠明顯增加骨髓,血液,脾臟組織中MDSC的比例。7.4 EZH2在造血前體細胞上是高表達的,在MDSC和巨噬細胞上是低表達的。7.5 GSK126能夠降低造血前體細胞上H3k27me3的表達水平。7.6 GSK126能夠促進造血前體細胞分化為MDSC。結論:GSK126介導的EZH2抑制能夠促進造血前體細胞分化為MDSC,從而導致腫瘤組織中MDSC增加,抑制抗腫瘤免疫應答。更重要的是,使用Gr-1清除抗體或者吉西他濱/5Fu能夠有效提高GSK126的抗腫瘤效應。從機制上來講,GSK126治療療效不佳是由增多的MDSC所導致的,有效地清除MDSC是發(fā)揮GSK126抗腫瘤效應的關鍵所在。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學博士學位論文/6 荷瘤小鼠進行了 GSK126 的注射，注射劑量為 150mg/kg。然而 C57B受了 GSK126 治療并不能有效地抑制 LLC 腫瘤生長。說明 GSK126 在免體內并沒有充分發(fā)揮其抗腫瘤效應（圖 1）。

陸軍軍醫(yī)大學博士學位論文.3.2 GSK126 并不能有效抑制免疫功能完全的 MC38 荷瘤小鼠腫瘤的生長了進一步驗證此現象具有普遍性，我們選用了 GSK126 藥物敏感性相似的C38 進行了相同的實驗。我們發(fā)現 GSK126 能夠明顯抑制免疫缺陷小鼠 M長。然而 C57BL/6 荷瘤小鼠接受了 GSK126 治療并不能有效地抑制 MC38 2）。

24圖 3 （A）WB 檢測 GSK126 處理后 LLC 細胞 EZH2,H3K27me3 的表達。（B） 流式細胞術檢測 GSK126 處理后 LLC 細胞 EZH2,H3K27me3 的表達。（C）WB 檢測 GSK126 處理后 MC38 細胞EZH2,H3K27me3 的表達。（D） 流式細胞術檢測 GSK126 處理后 MC38 細胞 EZH2,H3K27me3 的表達。（E）WB 檢測 GSK126 處理后 LLC 腫瘤 EZH2,H3K27me3 的表達。（F）流式細胞術檢測 GSK12處理后 LLC 腫瘤 EZH2,H3K27me3 的表達。（G）WB 檢測 GSK126 處理后 MC38 腫瘤EZH2,H3K27me3 的表達。（H） 流式細胞術檢測 GSK126 處理后 MC38 腫瘤 EZH2,H3K27me3 的表達。使用非配對 T 檢驗檢測統(tǒng)計學差異。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

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