【摘要】：目的:急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一組具有高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。近一半的AML患者表現(xiàn)為染色體核型正常(normal karyotype AML,NK-AML)。已知多種基因突變與NK-AML的發(fā)生密切相關(guān)。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)突變是NK-AML中突變頻率最高的基因之一,NPM1突變白血病已被2016年WHO白血病分型指南正式納入為AML的一個獨特亞型。然而,引起NPM1突變白血病惡性增殖的分子機(jī)制尚未完全闡明。II型磷脂酰肌醇4-磷酸酶(Inositol polyphospHate 4-phospHatase type II,INPP4B)是PI3K信號通路上的一種負(fù)調(diào)控因子,可通過抑制AKT的活化發(fā)揮抑癌作用。最近,來自白血病患者的臨床研究發(fā)現(xiàn),INPP4B在部分AML患者中高表達(dá)并表現(xiàn)出較差的存活率。然而,目前INPP4B在NPM1突變白血病細(xì)胞中的生物學(xué)作用及分子機(jī)制尚不清楚。因此,本研究旨在探討INPP4B對NPM1突變白血病細(xì)胞惡性增殖的影響及其潛在分子機(jī)制,并進(jìn)一步觀察INPP4B對NPM1突變白血病患者臨床預(yù)后的影響。方法:收集TCGA數(shù)據(jù)庫中171位AML患者的RNA-seq數(shù)據(jù)并分析INPP4B的表達(dá)水平。采用qRT-PCR和western blot觀察白血病細(xì)胞中INPP4B的mRNA和蛋白表達(dá)水平。采用CCK8和集落形成實驗檢測INPP4B表達(dá)對OCI-AML3細(xì)胞體外增殖的影響。通過western blot檢測SGK3和AKT蛋白磷酸化水平的改變。此外,采用ELISA分析過表達(dá)INPP4B后白血病細(xì)胞中PI(3,4)P_2和PI(3)P水平的變化。通過siRNA和rescue實驗觀察SGK3在INPP4B介導(dǎo)的細(xì)胞增殖中的作用。觀察干擾或過表達(dá)NPM1-mA(NPM1 type A mutation)后白血病細(xì)胞中INPP4B表達(dá)的改變。接著,觀察干擾Ets-1或使用ERK抑制劑PD98059對OCI-AML3細(xì)胞INPP4B mRNA和蛋白水平的影響。最后,收集TCGA數(shù)據(jù)庫中NPM1突變AML病例臨床信息,采用Kaplan-Meier生存分析INPP4B表達(dá)對NPM1突變AML患者臨床預(yù)后的影響。結(jié)果:首先,在NPM1突變白血病細(xì)胞中觀察到INPP4B mRNA和蛋白高表達(dá)。干擾INPP4B能夠抑制OCI-AML3細(xì)胞的體外增殖,而恢復(fù)INPP4B的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這種抑制效應(yīng)。其次,過表達(dá)INPP4B可上調(diào)OCI-AML3和THP-1細(xì)胞中SGK3的磷酸化(p-SGK3)水平,但不影響AKT的活化;反之亦然。接著,干擾SGK3可減弱OCI-AML3細(xì)胞的體外增殖能力,而rescue實驗觀察到恢復(fù)SGK3表達(dá)后能夠逆轉(zhuǎn)INPP4B下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞生長抑制。此外,證實了NPM1-mA可通過ERK/Ets-1信號通路上調(diào)OCI-AML3中INPP4B的表達(dá)。同時,干擾NPM1-mA能夠抑制OCI-AML3細(xì)胞的體外增殖,而回復(fù)INPP4B表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這種抑制效應(yīng)。最后,Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明,高INPP4B組NPM1突變白血病樣本總體生存率和三年無病生存率均顯著降低。結(jié)論:INPP4B在NPM1突變白血病細(xì)胞中高表達(dá)并可促進(jìn)其體外增殖,這可能與SGK3激活而非AKT有關(guān)。同時,NPM1-mA可通過ERK/Ets-1通路上調(diào)白血病細(xì)胞INPP4B的表達(dá)。此外,INPP4B高表達(dá)與NPM1突變白血病患者預(yù)后不良密切相關(guān)。深入研究INPP4B在NPM1突變白血病中的作用機(jī)制可能為臨床該型白血病的診治提供理論依據(jù)及潛在靶點。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.71
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文0.0246，圖 1-1B）。接著，在 5 種人髓系白血病細(xì)胞中檢測 INPP4B 質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，除了 HL60 和 KG1a 之外其余細(xì)胞株中均可P4B mRNA 的表達(dá)。值得注意的是，天然攜帶 NPM1 突變的 OCI-AMPP4B mRNA存在明顯高表達(dá)（圖1-1C）。同樣地，OCI-AML3細(xì)胞中IN水平也存在高表達(dá)（圖 1-1D）。以上結(jié)果表明，INPP4B 在 NPM1 突變現(xiàn)出相對較高的表達(dá)。

siINPP4B1和 siINPP4B2 組 INPP4B mRNA 水平較 Control 和 Mock 組顯著下降（p < 0.05，圖1-2A）。同時 western blot 結(jié)果顯示，siINPP4B1 和 siINPP4B2 組 INPP4B 蛋白水平較對照組明顯降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p < 0.05，圖 1-2B）。以上結(jié)果提示，成功構(gòu)建了干擾 INPP4B 的 OCI-AML3 白血病細(xì)胞株。圖 1-2 構(gòu)建干擾 INPP4B 的 OCI-AML3 細(xì)胞株Fig 1-2 The establishment OCI-AML3 cell lines with INPP4B knockdownA: qRT-PCR analysis of INPP4B expression from the OCI-AML3 cells transduced with the controlsiRNA or siINPP4B. B: western blotting analysis of INPP4B expression from the OCI-AML3 cellstransduced with the control siRNAor siINPP4B2.2.2 干擾 INPP4B 對白血病細(xì)胞體外增殖的影響為觀察 INPP4B 對 NPM1 突變白血病細(xì)胞體外增殖的影響，通過 CCK8 實驗檢測干擾 INPP4B 后 OCI-AML3 細(xì)胞生長能力的改變。結(jié)果顯示，與 Control 和 Mock組對比，siINPP4B1 和 siINPP4B2 組細(xì)胞生長能力顯著下降（p < 0.05

圖 1-3 干擾 INPP4B 對 OCI-AML3 細(xì)胞體外增殖的影響ig 1-3 The impact of INPP4B knockdown on cell proliferation in OCI-AML3 ceCK-8 assay analysis of cell proliferation activity in the siINPP4B transduced cells. BAML3 cells stably infected with shRNA lentivirus targeting INPP4B were subjected to ing assays. Rescue 實驗證實 INPP4B 對白血病細(xì)胞的促增殖作用了進(jìn)一步驗證 INPP4B 對 OCI-AML3 細(xì)胞體外增殖的影響，我們設(shè)計了ue 實驗。首先，采用靶向 INPP4B 的 shRNA 慢病毒載體感染 OCI-AML3 細(xì)功篩選出穩(wěn)定下調(diào) INPP4B 的細(xì)胞株（shINPPB-OCI-AML3）。接著，將EAK-Flag/INPP4B 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 shINPP4B-OCI-AML3 細(xì)胞，western blot 檢測。結(jié)果顯示，在 shINPP4B-OCI-AML3 細(xì)胞中過表達(dá) INPP4B 后，INPP平較 shINPP4B 組得以恢復(fù)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p < 0.05，圖 1-4A）。接

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本文編號：2761990