【摘要】：在癌細胞中,由于基因突變而異常高表達的蛋白常常分泌到血液中成為臨床腫瘤檢測的生物標志物,為癌癥早期的診斷和治療提供了依據。然而,這些標志物在腫瘤早期的含量往往是極低的,這就對準確的臨床預測診斷造成了困難。鄰位連接技術作為一種體外蛋白分析方法,由于其具有很高的檢測靈敏度,因而近年來得到廣泛應用。我們以免疫微球作為介質應用固相鄰位連接技術(spPLA)檢測前列腺特異性抗原(PSA),其最低檢測限為0.1 pM,與免疫PCR相比,背景信號值更低實驗重復性更好。并且將spPLA與環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)相結合,能夠檢測到PSA的最低濃度為0.001 pM,是傳統(tǒng)免疫檢測的100倍。為了使實驗操作更簡便,同時避免因洗滌微球帶來的實驗誤差,我們用戊二醛處理過的定量PCR管代替免疫微球,建立了一種以定量PCR管為固定相的更高效靈敏的蛋白檢測方法。該方法整個檢測過程都在定量PCR管中進行,洗滌方便,抗體固著穩(wěn)定,對PSA和野生型p53的檢測靈敏度為0.001 pM,并且能夠達到7個數量級的檢測范圍。而且,我們將突變體p53特異性抗體PAb240包被在管壁上,應用管壁spPLA可以檢測到血清中的突變體p53最低濃度為0.01 pM,其檢測靈敏度大約是傳統(tǒng)ELISA檢測的500倍。管壁spPLA能夠高效、靈敏檢測血清中痕量蛋白,并且操作簡單方便,有望成為癌癥早期臨床診斷的重要手段。由于小分子化合物自身結構的原因,兩個抗體無法同時識別一個小分子,因此鄰位連接技術(PLA)一直無法應用于小分子的高靈敏度檢測。我們的研究將多個小分子化合物偶聯到BSA上制成抗原,應用競爭免疫微球spPLA成功的檢測了萊克多巴胺和克倫特羅兩種“瘦肉精”小分子。其檢測靈敏度達到了0.01 ng/ml,是傳統(tǒng)免疫方法靈敏度的10-50倍,檢測范圍為7個數量級。與直接競爭法相比,間接競爭法將抗原直接包被于免疫微球上,能夠大大的節(jié)省抗體的使用量,檢測的線性范圍更好。并且將萊克多巴胺小分子化合物稀釋在不同的生物介質(尿液、血清和組織提取液)中,其檢測靈敏度依然很高,檢測范圍不變。小分子化合物的檢測常常出現交叉反應,影響檢測結果的準確性,我們用萊克多巴胺的類似物進行交叉反應實驗,其交叉反應率均小于0.01%。因此,我們實現了將核酸擴增的方法應用到小分子檢測中。另外,本論文應用熒光共振能量轉移技術(FRET)建立了一種新的快速、高效、具有高靈敏的檢測FEN1和DNA2核酸酶活性的均相檢測方法。該方法操作簡單,避免了放射性元素的使用,應用該技術篩選FEN1和DNA2的新型抑制劑分子必將更加容易。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.4

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本文編號：2761036