CD133-Pc通過Notch信號(hào)通路靶向殺傷結(jié)腸癌干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
發(fā)布時(shí)間:2020-07-18 12:31
【摘要】:目的研究偶聯(lián)CD133多肽的酞菁綴合物光敏劑(CD133 polypeptide-phthalocyanine conjugate,CD133-Pc)的光動(dòng)力治療(Photodynamic therapy,PDT)對(duì)人結(jié)腸癌干細(xì)胞(Colorectal cancer stem cells,CRC-CSCs)體外生物學(xué)特性的影響,并探討相關(guān)分子機(jī)制。方法1、CRC-CSCs分離、富集和鑒定。用磁珠分選技術(shù)分離出CD133+的結(jié)腸癌細(xì)胞;用結(jié)腸癌干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng),富集和擴(kuò)增CRC-CSCs;用流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志物CD133的表達(dá);用體外極限稀釋法驗(yàn)證CRC-CSCs的自我更新能力;用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測干性相關(guān)蛋白表達(dá);用裸鼠皮下移植瘤模型驗(yàn)證CRC-CSCs的致瘤性。2、觀察CD133-Pc細(xì)胞內(nèi)吞和亞細(xì)胞定位。將CD133-Pc或Pc孵育結(jié)腸癌親本細(xì)胞或CRC-CSCs,用熒光探針定位細(xì)胞器,用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察CD133-Pc和Pc的細(xì)胞內(nèi)吞和亞細(xì)胞定位。3、體外光動(dòng)力治療研究。用不同濃度CD133-Pc或傳統(tǒng)光敏劑處理永生化結(jié)腸上皮細(xì)胞、結(jié)腸癌親本細(xì)胞或CRC-CSCs后進(jìn)行激光照射,用Alamar Blue法測定細(xì)胞生存活力;用懸浮培養(yǎng)法測定結(jié)腸癌細(xì)胞的腫瘤球形成能力和CRC-CSCs的自我更新能力;蛋白質(zhì)免疫印跡檢測相關(guān)機(jī)制的蛋白水平變化;2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)孵育后用流式細(xì)胞儀檢測ROS水平;用流式細(xì)胞儀(AnnexinV/PI染色)檢測細(xì)胞凋亡;通過ROS抑制劑和自噬抑制劑驗(yàn)證ROS和自噬在光動(dòng)力治療中的作用。4、過表達(dá)Notch1。用攜帶嘌呤霉素抗性和過表達(dá)Notch1基因的慢病毒載體感染CRC-CSCs,用嘌呤霉素篩選構(gòu)建過表達(dá)Notch1的CRC-CSCs穩(wěn)定細(xì)胞系。結(jié)果1、經(jīng)磁珠分選和無血清超低粘附懸浮培養(yǎng)從人結(jié)腸癌親本細(xì)胞HT29和SW620中分離和富集CRC-CSCs;流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133表達(dá),分選后HT29和SW620的CD133陽性率分別為86.1%和98.6%;經(jīng)磁珠分選和超低粘附懸浮培養(yǎng)后,HT29和SW620的CD133、c-Myc、Nanog、Oct-4蛋白水平增加;裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRC-CSCs較親本細(xì)胞具有高兩個(gè)數(shù)量級(jí)的致瘤性。2、CRC-CSCs比結(jié)腸癌親本細(xì)胞內(nèi)吞CD133-Pc效率高;在結(jié)腸癌親本細(xì)胞中,高表達(dá)CD133的細(xì)胞內(nèi)吞CD133-Pc效率高;在CRC-CSCs中,內(nèi)吞CD133-Pc效率高于Pc;CD133-Pc聚集在線粒體、溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。3、隨CD133-Pc的濃度升高,PDT降低結(jié)腸上皮細(xì)胞、結(jié)腸癌親本細(xì)胞和CRC-CSCs的生存活力,但是CD133-Pc PDT對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用大于永生化結(jié)腸上皮細(xì)胞;CD133-Pc的殺傷作用強(qiáng)于傳統(tǒng)光敏劑Photosan和未偶聯(lián)CD133的Pc;CD133-Pc PDT對(duì)CRC-CSCs的殺傷作用隨激光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng);在體外,CD133-Pc PDT 1小時(shí)細(xì)胞即發(fā)生形態(tài)改變。4、CD133-Pc PDT抑制結(jié)腸癌親本細(xì)胞的腫瘤球形成和CRC-CSCs的自我更新能力;CD133-PcPDT降低CRC-CSCs中的Notch1和Nanog蛋白水平;過表達(dá)Notch1的CRC-CSCs抵抗CD133-Pc PDT。5、經(jīng)不同濃度CD133-Pc對(duì)CRC-CSCs進(jìn)行光動(dòng)力處理,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨CD133-Pc濃度增加而增高;同時(shí)Nrf2和Keap1蛋白水平隨CD133-Pc濃度增高而增高;添加ROS抑制劑后能夠逆轉(zhuǎn)CD133-Pc PDT對(duì)CRC-CSCs的生存活力的抑制作用。6、經(jīng)不同濃度CD133-Pc對(duì)CRC-CSCs進(jìn)行光動(dòng)力處理,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示細(xì)胞的凋亡比例隨CD133-Pc濃度增加而增高。7、經(jīng)不同濃度CD133-Pc對(duì)CRC-CSCs進(jìn)行光動(dòng)力處理,免疫熒光結(jié)果顯示隨CD133-Pc濃度增加,LC3表達(dá)逐漸增多;蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示CD133-Pc PDT促進(jìn)CRC-CSCs的自噬;添加自噬抑制劑后能夠逆轉(zhuǎn)CD133-Pc PDT對(duì)CRC-CSCs的生存活力的抑制作用。結(jié)論1.通過磁珠分選CD133+細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)法分離和富集的CRC-CSCs具有結(jié)腸癌干細(xì)胞特性。2.CD133-Pc PDT在體外能夠有效殺傷CRC-CSCs。3.CD133-Pc PDT的殺傷作用的機(jī)制是細(xì)胞通過內(nèi)吞CD133-Pc后,經(jīng)激光照射產(chǎn)生ROS,抑制Notch信號(hào)通路,進(jìn)而抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性特征和誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。
【學(xué)位授予單位】:湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類號(hào)】:R735.35
【圖文】:
PCs和SW620邋PCs中培養(yǎng)出CRC-CSCs,即HT29CSCs和SW620CSCs。CRC-CSCs逡逑在體外培養(yǎng)條件下7天能完全形成腫瘤球,與未經(jīng)超低粘附懸浮培養(yǎng)的PCs形成逡逑明顯的形態(tài)學(xué)差異(圖1)。逡逑HT29邋CSCs邐HT29邋PCs逡逑Day1邐Day邋3邐Day邋7逡逑>邋^邋'邋'邋、J邋,逡逑\邐y/.邐卜、逡逑:>邐:;A:邋)邐3逡逑ll邐^邐,邋'Y」逡逑SW620邋CSCs邐SW620邋PCs逡逑Day邋1邐Day邋3邐Day邋7逡逑__邋l邋[邐^邐z1邋f邋r,邋0逡逑圖1來源于HT29和SW620的CRC-CSCs腫瘤球形成。用無血清超低粘附懸浮培養(yǎng)法從逡逑HT29和SW620細(xì)胞培養(yǎng)出CRC-CSCs。左側(cè)照片顯示不同的時(shí)間(天)腫瘤球的形成情況。逡逑原放大倍數(shù):200><。右側(cè)照片顯示親本細(xì)胞生長情況。原放大倍數(shù):200x。逡逑3.邋1.2邋CRC-CSCs邋的鑒定逡逑用抗CD133的PE熒光抗體標(biāo)記HT29邋PCs和SW620邋PCs細(xì)胞。經(jīng)磁珠分逡逑選后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的CD133的陽性率。結(jié)果顯示HT29和SW620的結(jié)逡逑腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133+的細(xì)胞分別約占細(xì)胞總數(shù)的86.1%和98.6%邋(圖逡逑13邐_逡逑
圖2結(jié)腸癌干細(xì)胞的鑒定。A:流式細(xì)胞術(shù)檢測磁珠分選前后HT29和SW620的結(jié)腸癌干逡逑細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133的細(xì)胞陽性率。B:蛋白質(zhì)免疫印跡分析比較CRC-PCs和CRC-CSCs逡逑中CD133和c-Myc的蛋白水平。C:激光共聚焦顯微鏡觀察比較CRC-PCs和CRC-CSCs中逡逑Nanog,邋Oct-4的表達(dá),原放大倍數(shù)630x。D:第25代SW620CSCs用無血清超低粘附懸浮逡逑培養(yǎng)法將SW620邋CSCs連續(xù)傳代25代。照片顯示不同的時(shí)間(天)腫瘤球的形成情況。原放逡逑大倍數(shù):200x。E:邋PCs邋和邋CSCs邋體外成球能力比較。將邋HT29PCs,SW620PCs,HT29CSCS逡逑和SW620邋CSCs分別以每孔500、100、20、4個(gè)細(xì)胞接種在超低粘附96孔板中,無血清培逡逑養(yǎng)7天。照片和柱狀圖顯示腫瘤球的形成情況。原放大倍數(shù):200><。逡逑
24小時(shí)后檢測細(xì)胞生存活力。NCM460的IC50值為3.177pM,明顯逡逑高于結(jié)腸癌細(xì)胞的邋IC50值(HT29:邋1.88邋pM,邋SW620:邋1.56|aM,HCT116:邋1.09pM,逡逑LoVo:邋0.87|_iM)(圖3)。表明CD133-PC對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞更具殺傷力。逡逑18逡逑
本文編號(hào):2760892
【學(xué)位授予單位】:湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類號(hào)】:R735.35
【圖文】:
PCs和SW620邋PCs中培養(yǎng)出CRC-CSCs,即HT29CSCs和SW620CSCs。CRC-CSCs逡逑在體外培養(yǎng)條件下7天能完全形成腫瘤球,與未經(jīng)超低粘附懸浮培養(yǎng)的PCs形成逡逑明顯的形態(tài)學(xué)差異(圖1)。逡逑HT29邋CSCs邐HT29邋PCs逡逑Day1邐Day邋3邐Day邋7逡逑>邋^邋'邋'邋、J邋,逡逑\邐y/.邐卜、逡逑:>邐:;A:邋)邐3逡逑ll邐^邐,邋'Y」逡逑SW620邋CSCs邐SW620邋PCs逡逑Day邋1邐Day邋3邐Day邋7逡逑__邋l邋[邐^邐z1邋f邋r,邋0逡逑圖1來源于HT29和SW620的CRC-CSCs腫瘤球形成。用無血清超低粘附懸浮培養(yǎng)法從逡逑HT29和SW620細(xì)胞培養(yǎng)出CRC-CSCs。左側(cè)照片顯示不同的時(shí)間(天)腫瘤球的形成情況。逡逑原放大倍數(shù):200><。右側(cè)照片顯示親本細(xì)胞生長情況。原放大倍數(shù):200x。逡逑3.邋1.2邋CRC-CSCs邋的鑒定逡逑用抗CD133的PE熒光抗體標(biāo)記HT29邋PCs和SW620邋PCs細(xì)胞。經(jīng)磁珠分逡逑選后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的CD133的陽性率。結(jié)果顯示HT29和SW620的結(jié)逡逑腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133+的細(xì)胞分別約占細(xì)胞總數(shù)的86.1%和98.6%邋(圖逡逑13邐_逡逑
圖2結(jié)腸癌干細(xì)胞的鑒定。A:流式細(xì)胞術(shù)檢測磁珠分選前后HT29和SW620的結(jié)腸癌干逡逑細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133的細(xì)胞陽性率。B:蛋白質(zhì)免疫印跡分析比較CRC-PCs和CRC-CSCs逡逑中CD133和c-Myc的蛋白水平。C:激光共聚焦顯微鏡觀察比較CRC-PCs和CRC-CSCs中逡逑Nanog,邋Oct-4的表達(dá),原放大倍數(shù)630x。D:第25代SW620CSCs用無血清超低粘附懸浮逡逑培養(yǎng)法將SW620邋CSCs連續(xù)傳代25代。照片顯示不同的時(shí)間(天)腫瘤球的形成情況。原放逡逑大倍數(shù):200x。E:邋PCs邋和邋CSCs邋體外成球能力比較。將邋HT29PCs,SW620PCs,HT29CSCS逡逑和SW620邋CSCs分別以每孔500、100、20、4個(gè)細(xì)胞接種在超低粘附96孔板中,無血清培逡逑養(yǎng)7天。照片和柱狀圖顯示腫瘤球的形成情況。原放大倍數(shù):200><。逡逑
24小時(shí)后檢測細(xì)胞生存活力。NCM460的IC50值為3.177pM,明顯逡逑高于結(jié)腸癌細(xì)胞的邋IC50值(HT29:邋1.88邋pM,邋SW620:邋1.56|aM,HCT116:邋1.09pM,逡逑LoVo:邋0.87|_iM)(圖3)。表明CD133-PC對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞更具殺傷力。逡逑18逡逑
【參考文獻(xiàn)】
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1 趙萍;王攀;王筱冰;;程序性細(xì)胞死亡與腫瘤[J];生命科學(xué);2011年04期
本文編號(hào):2760892
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