【摘要】：臨床上惡性實體瘤的治療策略主要有兩種,一是直接殺傷腫瘤細胞,二是抑制腫瘤組織的血液供應(yīng),本課題中將兩種抗腫瘤候選藥物,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing Iigand, TRAIL)及內(nèi)源性血管生長抑制因子vasostatin進行融合表達,旨在構(gòu)建出一種具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制血管形成的雙功能蛋白,將兩種腫瘤治療策略進行結(jié)合進而產(chǎn)生更優(yōu)的抗腫瘤功效。論文工作主要圍繞雙功能融合蛋白VAS-TRAIL的構(gòu)建表達、制備與活性研究展開,探索確定了融合蛋白表達與制備的工藝路線,并采用蛋白質(zhì)工程手段提高了融合蛋白的復(fù)性率及生物活性,為VAS-TRAIL融合蛋白運用于抗腫瘤研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本論文的主要研究內(nèi)容與結(jié)論概括如下：1) VAS-TRAIL融合蛋白的克隆與表達根據(jù)兩個結(jié)構(gòu)域不同的拼接策略構(gòu)建了TRAIL-VAS及VAS-TRAIL融合基因,并在大腸桿菌系統(tǒng)中進行了重組表達；篩選和比較了MBP及SUMO融合標簽對融合蛋白可溶表達的影響,結(jié)果表明只有MBP融合標簽可以實現(xiàn)融合蛋白的高效可溶表達,但在酶切去除MBP標簽的過程中目的蛋白被降解。由此確定表達不帶有標簽的TRAIL-VAS及VAS-TRAIL融合蛋白,兩種融合蛋白在pET28a(+)/BL21(DE3)系統(tǒng)中以包涵體形式大量表達。2)融合蛋白的體外變復(fù)性研究為了確定TRAIL-VAS及VAS-TRAIL的融合蛋白的體外變復(fù)性方法,通過一系列的單因素實驗,確定了采用8M尿素溶解包涵體,復(fù)性緩沖液中添加精氨酸、Zn2+及還原劑β巰基乙醇,然后采用尿素梯度透析進行融合蛋白的體外復(fù)性,成功得到了可溶形式的TRAIL-VAS及VAS-TRAIL融合蛋白。對復(fù)性后的TRAIL-VAS及VAS-TRAIL融合蛋白進行活性測定,檢測了融合蛋白對胰腺癌細胞株SW1990、非小細胞肺癌細胞株NCI-H460及內(nèi)皮細胞FBHE的殺傷作用,發(fā)現(xiàn)TRAIL-VAS蛋白對三種細胞沒有明顯作用；VAS-TRAIL蛋白對SW1990、NCI-H460細胞具有劑量依賴性的殺傷作用,但對FBHE細胞沒有明顯的殺傷作用,顯示VAS-TRAIL相比TRAIL-VAS是更優(yōu)的融合蛋白拼接順序,因此以VAS-TRAIL分子為對象進行進一步研究。3)基于包涵體構(gòu)象及活性的融合蛋白連接臂選擇策略在融合蛋白兩個結(jié)構(gòu)域之間插入連接臂可以減輕結(jié)構(gòu)域之間的空間干擾并提高活性,為了實現(xiàn)快速且準確的連接臂篩選,本研究中提出了一種新的融合蛋白連接臂選擇策略,研究利用融合蛋白包涵體的構(gòu)象特性結(jié)合包涵體活性測定來預(yù)測連接臂對融合蛋白復(fù)性及活性的影響。本方法首先將3種較常用的連接臂,柔性連接臂FL ((GGGGS) 3)，剛性連接臂RL ((PAPAP) 3)以及螺旋結(jié)構(gòu)連接臂HL ((EAAAK) 3)，插入到VAS-TRAIL融合蛋白兩個結(jié)構(gòu)域之間,分別得到含有不同連接臂的融合蛋白VFT、 VRT及VHT,并重組表達得到融合蛋白包涵體。然后利用ATR-FTIR檢測包涵體內(nèi)部結(jié)構(gòu)并對包涵體進行直接測活,根據(jù)包涵體的構(gòu)象及活性結(jié)果預(yù)測最佳的連接臂選擇。實驗表明,與不含有連接臂的VAS-TRAIL融合蛋白VT相比,插入連接臂能夠明顯提高融合蛋白包涵體中的類天然二級結(jié)構(gòu)含量。插入剛性連接臂的融合蛋白VRT包涵體中含有最高的類天然二級結(jié)構(gòu)含量,且VRT包涵體保留了部分的活性,可以殺傷NCI-H460細胞但對FBHE細胞無明顯作用,因此我們預(yù)測剛性連接臂(PAPAP) 3是更優(yōu)的連接臂選擇。4)建立三重促溶系統(tǒng)溶解和復(fù)性融合蛋白包涵體在基于VAS-TRAIL融合蛋白包涵體含有類天然二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,研究出一種包涵體溫和變性方法以進一步提高VAS-TRAIL融合蛋白包涵體的復(fù)性收率。該方法利用2M尿素、0.4M精氨酸、pH11.5的緩沖液組成的三重促溶系統(tǒng)進行VRT包涵體的溫和溶解和復(fù)性。研究表明,更高濃度的尿素可以一定程度提高包涵體的溶解率,但是含有2M尿素的三重促溶溶液能夠更有效保留包涵體內(nèi)已有二級結(jié)構(gòu)特性,且溶解包涵體所得蛋白的純度較高。復(fù)性結(jié)果顯示,三重促溶系統(tǒng)溶解的VRT包涵體蛋白經(jīng)尿素梯度透析復(fù)性后,復(fù)性收率為46%,大大高于用8M尿素溶解的VRT包涵體融合蛋白的0.81%。在此基礎(chǔ)上,我們對精氨酸在三重變性劑中的作用進行了研究,通過與添加相同尿素但不含精氨酸的堿性緩沖液的復(fù)性結(jié)果對比,發(fā)現(xiàn)添加精氨酸能更有效保持包涵體內(nèi)的二級結(jié)構(gòu),融合蛋白的復(fù)性收率(46%)也明顯高于不添加精氨酸的堿性包涵體溶解液(22%),表明精氨酸在三重促溶系統(tǒng)溶解和復(fù)性融合蛋白包涵體中是不可或缺的。5)基于包涵體構(gòu)象及活性的融合蛋白連接臂選擇策略的驗證為了驗證上述3)中的連接臂選擇策略,我們將上述3)中構(gòu)建的VAS-TRAIL融合蛋白包涵體經(jīng)三重促溶系統(tǒng)進行復(fù)性并進行活性測定。結(jié)果表明,所有帶有連接臂的VAS-TRAIL蛋白復(fù)性收率(均高于40%)顯著高于不含有連接臂的VT融合蛋白(23%)。帶有螺旋結(jié)構(gòu)連接臂的VHT蛋白具有最高的復(fù)性收率,而復(fù)性后的VRT具有最高的活性。根據(jù)VRT及VHT融合蛋白的同源模型,顯示VRT蛋白的vasostatin結(jié)構(gòu)域?qū)ζ鋝TRAIL結(jié)構(gòu)域形成三聚體的干擾小于VHT,因此推測有利于其活性的發(fā)揮。以上結(jié)果表明,剛性連接臂(PAPAP) 3相較于其他連接臂,能夠在提高VAS-TRAIL融合蛋白復(fù)性收率的同時獲得最佳的活性,此結(jié)果驗證了我們提出的基于包涵體構(gòu)象及活性的融合蛋白連接臂選擇策略的有效性。該連接臂選擇策略不需要事先進行蛋白質(zhì)的變復(fù)性操作,有助于提高易聚集融合蛋白的連接臂篩選通量,加快融合蛋白藥物的開發(fā)進程。圓二色譜分析表明復(fù)性后的VRT融合蛋白富含p折疊結(jié)構(gòu),且VRT蛋白能形成同源三聚體,說明VRT融合蛋白得到了正確的復(fù)性。VRT蛋白能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的NCI-H460腫瘤細胞及FBHE內(nèi)皮細胞的凋亡,其對腫瘤細胞的殺傷作用與sTRAIL相當,對內(nèi)皮細胞的殺傷作用高于單獨的sTRAIL及vasostatin,顯示出VRT蛋白在抗腫瘤治療研究與應(yīng)用中的前景。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R73-36
【圖文】：

化和傷口愈合的過程中。逡逑原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)生發(fā)展都離不開血管新生，新血管的形成為腫瘤的逡逑生長和侵入正常組織提供了養(yǎng)分（圖１．３）。在腫瘤血管未形成時，腫瘤細施與組逡逑織主要依靠細胞間隙的彌散供養(yǎng)，由于彌散無法保證腫瘤細胞足夠的氧氣和營逡逑養(yǎng)，腫瘤的大小受到限制。腫瘤細胞由于受到缺氧等環(huán)境壓力，會分泌一些血管逡逑生成促進因子來促進腫瘤血管的形成，在腫瘤血管形成后，腫瘤組織Ｗ灌注方式逡逑獲得營養(yǎng)，自此腫瘤指數(shù)形式增長，并且腫瘤細胞會隨著腫瘤血管進入血液循逡逑環(huán)系統(tǒng)，并在遠離原發(fā)病化的部位形成腫瘤轉(zhuǎn)移。由此可見，腫瘤血管的形成與逡逑腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。逡逑片暑U五義賢跡保持琢鲅芐緯懾義希疲椋紓澹保沖澹疲錚潁恚椋睿玨澹錚駑澹簦酰恚錚蟈澹觶澹螅螅澹戾義希保常慚萇梢種屏品ㄓ胙萇梢種埔蜃渝義閑律芐緯墑且桓齦叢擁墓�，它包括了恼~は赴腦鮒秤肭ㄒ�，１＾及细辶x習(xí)饣實暮銑捎虢到�，其中影响血蛊S緯勺罟丶囊蛩厥牽貉萇紗俳蜃渝義嫌胙萇梢種埔蜃擁鈉膠狻Ｔ謖５納磣刺

本文編號：2759497