【摘要】：【背景】MicroRNAs(miRNAs)是一類長度為21-25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,可以通過特異性地識別和結(jié)合3’-UTR區(qū)的互補序列,降解或抑制mRNA的翻譯來抑制靶基因的表達。它們廣泛參與了細胞分化、增殖、凋亡、組織器官發(fā)育等生理過程,也是腫瘤惡性行為的重要調(diào)控因子。因為miRNA在進化上的保守性和在細胞內(nèi)作用的廣泛性,在各種腫瘤細胞中表達異常的miRNA,尤其是廣泛下調(diào)的抑癌性miRNA一直被認為是激活癌基因、促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因子。Wnt信號作為影響細胞生長發(fā)育的關(guān)鍵性通路,已被證實在很多腫瘤中異常表達,其中最常見的便是結(jié)腸癌。經(jīng)典的Wnt信號由細胞內(nèi)抑癌基因APC的突變移除或致癌基因β-catenin的激活啟動,繼而通過β-catenin在細胞核內(nèi)的聚積及其與轉(zhuǎn)錄因子TCF4的結(jié)合激活下游基因c-Myc和CCND1等的轉(zhuǎn)錄。除這一經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄激活作用外,不少研究也證實了TCF4單獨或與β-catenin一起對Wnt通路下游基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。在這些受調(diào)控的基因中,近期研究報道了miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,也分布在Wnt通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。其中受Wn信號負性調(diào)控的抑癌性miRNA,雖然被報道過,但作為一個經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄激活性通路,Wnt是如何抑制這些抑癌性miRNA表達的機制確從未被揭示過。本課題將對這一未回答的問題進行研究。【目的】研究結(jié)腸癌中Wnt信號調(diào)控miRNA的分子機制,探索這些miRNA在腫瘤惡性行為中的作用與功能,為結(jié)腸癌的診斷及治療提供新的靶點。【方法】第一部分:通過分析TCF4在HCT116細胞中的ChIP-seq數(shù)據(jù)庫、干擾內(nèi)源性TCF4表達以及對候選miRNA啟動子區(qū)的ChIP-qPCR檢測,確定要研究的被Wnt信號調(diào)控的miRNA;在激活和抑制Wnt信號的情況下,用qPCR檢測該miRNA的表達以確定調(diào)控關(guān)系;通過ChIP-qPCR檢測該miRNA啟動子區(qū)是否有Wnt信號核心轉(zhuǎn)錄復(fù)合物TCF4-β-catenin的結(jié)合富集。第二部分:通過GEO數(shù)據(jù)庫分析和臨床標本的檢測,確定研究對象miR-145在原發(fā)和轉(zhuǎn)移結(jié)腸腫瘤中的表達差異;通過劃痕和Transwell實驗,在體外驗證miR-145對結(jié)腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移功能的影響;通過建立裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移模型,在體內(nèi)驗證miR-145對結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移的影響。第三部分:通過Western Blot和熒光素酶報告基因驗證miR-145影響結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的靶基因;通過回復(fù)實驗驗證miR-145是否通過該靶基因影響結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移功能;在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的動物模型和臨床標本中檢測miR-145及其靶基因表達的相互關(guān)系。第四部分:通過ChIP-qPCR檢測miR-145啟動子區(qū)是否有H3K27me3及其甲基化酶PRC2復(fù)合物的富集,并通過GSK-J4增加或siEZH2/siSUZ12干擾這些成分的表達,觀察miR-145的水平是否會隨之變化;通過Co-IP及Re-ChIP實驗驗證TCF4-β-catenin復(fù)合物是否能和PRC2復(fù)合物在TCF4結(jié)合位點發(fā)生直接作用;同樣用ChIP-qPCR檢測H3K27me3和PRC2復(fù)合物在啟動子區(qū)的富集狀況,并在提升胞內(nèi)H3K27me3水平或干擾PRC2復(fù)合物時檢測表達水平,驗證其他候選的Wnt信號負調(diào)miRNA是否也存在類似的調(diào)控規(guī)律。第五部分:通過在結(jié)腸癌細胞中轉(zhuǎn)染mimic miR-145后用TOP-Flash/FOP-Flash報告基因檢測Wnt信號的活性、用qPCR檢測pre-miR-145的表達以及用ChIP-qPCR檢測miR-145的負調(diào)因子在其啟動子區(qū)的富集情況,確定miR-145是否可反向抑制Wnt信號形成負反饋環(huán)路;通過RNA Hybrid軟件分析、Western Blot和熒光素酶報告基因驗證miR-145反向抑制其負調(diào)因子時靶向的基因;在裸鼠成瘤模型和臨床病例的標本中驗證miR-145及其負調(diào)因子形成的雙負反饋環(huán)路。【結(jié)果】第一部分:在一系列篩選和檢測中我們發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌細胞中干擾內(nèi)源性TCF4表達后,miR-145的表達上升最為明顯,并且其上游啟動子區(qū)具有最顯著的TCF4富集,讓我們決定選擇miR-145作為具體研究的對象;在Wnt信號激活和抑制的情形下,miR-145的表達分別出現(xiàn)了下降和上升;我們在miR-145的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了TCF4的結(jié)合位點,ChIP-qPCR檢測的結(jié)果顯示,在該位點附近有顯著的TCF4-β-catenin結(jié)合富集。第二部分:GEO數(shù)據(jù)庫的分析及41對嚴格匹配的結(jié)腸癌原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤檢測結(jié)果顯示,miR-145在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移瘤中的表達顯著下調(diào);劃痕和Transwell實驗的結(jié)果顯示,miR-145可在體外有效抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移;裸鼠轉(zhuǎn)移模型的結(jié)果顯示,miR-145可在體內(nèi)有效抑制結(jié)腸癌細胞向肝臟和肺臟發(fā)生轉(zhuǎn)移。第三部分:Western Blot和熒光素酶報告基因的結(jié)果顯示,miR-145可特異性結(jié)合在LASP1的3’-UTR區(qū),靶向沉默其表達;回復(fù)實驗的結(jié)果顯示,LASP1的回復(fù)表達可部分中和miR-145對結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用,說明miR-145的確通過靶向沉默LASP1的表達抑制結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移;miR-145與LASP1的表達在結(jié)腸癌肝和肺轉(zhuǎn)移的動物模型以及41例轉(zhuǎn)移癌的臨床標本中,都呈負性相關(guān)關(guān)系。第四部分:ChIP-qPCR檢測顯示miR-145啟動子區(qū)的TCF4結(jié)合位點處有顯著的H3K27me3及PRC2復(fù)合物的富集,用GSK-J4處理細胞使胞內(nèi)H3K27me3水平增加時,miR-145表達下調(diào),而用siEZH2/siSUZ12干擾PRC2復(fù)合物的表達富集時,miR-145的表達水平上升;Co-IP和Re-ChIP實驗的結(jié)果顯示,TCF4-β-catenin復(fù)合物可在miR-145啟動子區(qū)的TCF4結(jié)合位點通過直接結(jié)合的方式招募PRC2復(fù)合物,使其對該區(qū)域的組蛋白進行H3K27三甲基化,下調(diào)miR-145的表達;在候選的同樣受Wnt信號負調(diào)的抑癌性miRNA中,miR-132/212的啟動子區(qū)亦具備類似的調(diào)控模式。第五部分:在結(jié)腸癌細胞中轉(zhuǎn)染mimic miR-145后,我們發(fā)現(xiàn)了Wnt信號活性的下降、pre-miR-145表達穩(wěn)定而持續(xù)的上升以及在其啟動子區(qū)結(jié)合的TCF4-β-catenin和PRC2復(fù)合物的富集下降,說明miR-145的確能反向抑制其負調(diào)因子;Western Blot和熒光素酶報告基因的結(jié)果顯示,miR-145可直接結(jié)合在TCF4和SUZ12的3’-UTR區(qū),靶向抑制其表達,與負調(diào)它的TCF4-β-catenin和PRC2復(fù)合物形成了雙向負性的反饋環(huán)路;在裸鼠成瘤模型和臨床病例的分析中,我們觀察到miR-145的表達與其負性調(diào)控因子或靶分子之間,都呈現(xiàn)出負性相關(guān)關(guān)系�！窘Y(jié)論】1.miR-145能通過靶向沉默LASP1來抑制結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的能力;2.Wnt信號通過TCF4-β-catenin復(fù)合物結(jié)合在miR-145等抑癌性miRNA上游啟動子區(qū)的TCF4結(jié)合位點,并招募PRC2復(fù)合物對這一區(qū)域的組蛋白進行H3K27三甲基化,從而實現(xiàn)對miR-145等抑癌性miRNA的負性調(diào)控;3.miR-145可通過靶向沉默TCF4和SUZ12這兩個關(guān)鍵的負調(diào)因子,與Wnt信號及PRC2復(fù)合物形成雙負反饋的調(diào)控環(huán)路。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.35
【圖文】：

圖 1：miRNA 的生物學合成過程，引自 Biomed Pharmacother. 2018 Jan;97:1319-13301.2 miRNA 的作用特點miRNA 在脊椎動物、無脊椎動物和植物中都具有高度保守性，并通過對靶向mRNA 阻斷翻譯過程和進行降解，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用[9]。1993 年，美國哈佛大學的研究人員首次報道了在秀隱線蟲的生物學功能中發(fā)揮作用的 lin-4[10]。

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文體內(nèi)多達三分之一的基因的表達[12]。也有越來越多的證據(jù)表明，異常表達的 miRNA對各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性行為都有重要影響，可以表現(xiàn)為下調(diào)抑癌基因的致癌性 miRNA 表達上調(diào)，或靶向致癌基因的抑癌性 miRNA 表達下降[13, 14]。2. miRNA 在結(jié)腸癌分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的研究現(xiàn)狀越來越多的證據(jù)表明，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與致癌性信號通路的激活和抑癌性通路的失活相關(guān)，其中，基礎(chǔ)實驗和臨床流行病學的研究也表明，miRNA 在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[15]。已有的研究顯示，miRNA 可通過間接或直接調(diào)控 Wnt、Ras、TGF-β和炎癥反應(yīng)等致癌性通路[16]，也可通過影響結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力及腫瘤干細胞的功能等方面參與其惡性進程[17]（圖 2）。

究人員還發(fā)現(xiàn)，miR-93 不論在結(jié)腸癌細胞系還是臨床標本中，都呈現(xiàn)且具有抑制 Wnt 通路組分的潛在作用[84]；進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-93 是幫助β-catenin 入核的蛋白 smad-7 來降低 Wnt 通路活性的[85]。miR-101癌細胞中抑制 Wnt 通路的活性，在細胞內(nèi)過表達 miR-101 能降低細胞環(huán)境下生長和侵襲遷移的能力[86]。近年來關(guān)于結(jié)腸癌細胞中重要的miR-145 的研究顯示，它能通過靶向抑制 cateninδ-1 這一結(jié)合于 p21 活（PAK4）參與細胞骨架重塑的蛋白，PAK4 是幫助β-catenin 入核轉(zhuǎn)運的iR-145 能通過減低β-catenin 的入核，來抑制 Wnt 通路活性發(fā)揮抑癌功，miR-506 和 miR-320a 在結(jié)腸癌中的表達也顯著下降，它們能通過抑身或下游的效應(yīng)分子 c-Myc 和 cyclin D1 來阻礙腫瘤的發(fā)生發(fā)展[88, 89]。明，無論致癌還是抑癌性的 miRNA，都通過調(diào)控或被調(diào)控的方式與 W網(wǎng)絡(luò)交織在一起，在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用（圖 3）。

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