【摘要】：發(fā)展高特異性的分子識別探針及高靈敏的分析檢測方法對實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷、轉(zhuǎn)移預(yù)警和療效評估等具有非常重要的意義。核酸適配體(Aptamer)作為一種新型的能特異識別腫瘤細(xì)胞及相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的分子識別探針,具備高親和力、高特異性、易合成、易修飾、性質(zhì)穩(wěn)定、設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)勢,已在腫瘤的分子診斷、靶向治療及相關(guān)基礎(chǔ)研究中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢和重要應(yīng)用價值。然而,目前常用的基于Aptamer的腫瘤分析檢測往往存在檢測背景高、設(shè)計(jì)困難和檢測靈敏度不高等缺點(diǎn);此外,現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞特異性Aptamer數(shù)量及其靶標(biāo)信息仍非常有限,嚴(yán)重限制了Aptamer的廣泛應(yīng)用�；诖�,本論文針對上述關(guān)鍵性問題,以發(fā)展新型腫瘤高靈敏檢測探針和分析方法為目標(biāo),采用腫瘤細(xì)胞特異性Aptamer,通過引入熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號轉(zhuǎn)換機(jī)制和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)放大機(jī)制,構(gòu)建和發(fā)展了一系列低背景、高信號輸出的Aptamer熒光探針和分析方法,系統(tǒng)地開展了腫瘤細(xì)胞的高靈敏檢測、腫瘤細(xì)胞表面特異性糖基化增強(qiáng)性成像以及轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和組織特異性成像研究。具體研究內(nèi)容如下:一、基于裂開型Aptamer的發(fā)夾式熒光探針設(shè)計(jì)及用于腫瘤細(xì)胞檢測研究針對常規(guī)Aptamer熒光探針一般依賴于Aptamer整個分子進(jìn)行設(shè)計(jì)而導(dǎo)致的序列較長和設(shè)計(jì)困難等問題,本章基于FRET技術(shù)和裂開型Aptamer,設(shè)計(jì)和發(fā)展了一種發(fā)夾式裂開型Aptamer熒光探針(HSAP)用于腫瘤細(xì)胞的靈敏檢測。該探針不僅序列短,且設(shè)計(jì)簡單方便,背景信號低。以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞為檢測靶細(xì)胞,HSAP可在100μL結(jié)合緩沖液中最低檢測到24個細(xì)胞,且能夠在50%人血清復(fù)雜樣品中實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的定量檢測。同時,HSAP具有良好的選擇性,能夠特異性識別混合細(xì)胞樣品中的靶細(xì)胞。此外,該探針可在15分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)對靶細(xì)胞的一步式檢測,而無需任何洗滌和預(yù)處理。這種快速、簡便、靈敏和特異性的腫瘤細(xì)胞檢測探針為腫瘤和醫(yī)學(xué)診斷研究提供了一種有力的工具。二、基于靶標(biāo)誘導(dǎo)雙鏈?zhǔn)搅验_型Aptamer熒光探針重組裝高靈敏檢測腫瘤細(xì)胞研究上述發(fā)夾式Aptamer熒光探針是一種基于分子內(nèi)FRET模式的檢測探針,雖然靶標(biāo)結(jié)合能夠誘導(dǎo)探針構(gòu)象變化而產(chǎn)生信號,但由于淬滅基團(tuán)仍位于探針上,在一定程度上仍有FRET發(fā)生,導(dǎo)致探針熒光不能夠完全恢復(fù)。針對此問題,本工作設(shè)計(jì)了一種基于分子間FRET的雙鏈?zhǔn)搅验_型Aptamer熒光探針(DSAP)用于腫瘤細(xì)胞高靈敏檢測。在自然狀態(tài)下,DSAP由于發(fā)生FRET,熒光被淬滅;當(dāng)靶細(xì)胞存在時,靶細(xì)胞結(jié)合誘導(dǎo)DSAP發(fā)生重組裝,使帶淬滅基團(tuán)的序列從雙鏈探針上解離,從而使熒光完全恢復(fù),產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號,大大提高了檢測靈敏度。此外,通過在裂開型探針上分別標(biāo)記不同的熒光分子,可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對靶細(xì)胞的雙信號檢測,有效地避免假陽性和假陰性信號。該方法簡單、快速、無需洗滌和分離,靈敏度高,檢測信背比高達(dá)40倍,可實(shí)現(xiàn)對100μL結(jié)合緩沖液中7個腫瘤細(xì)胞的檢測,并且還進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了含50%人血清復(fù)雜樣品和混合細(xì)胞的檢測,有望為腫瘤細(xì)胞的臨床診斷和研究提供一種新的高靈敏技術(shù)和方法。三、基于FRET和代謝糖標(biāo)記技術(shù)的Aptamer導(dǎo)向的腫瘤細(xì)胞表面特異性糖基化成像研究異常的細(xì)胞表面糖基化通常與腫瘤的早期發(fā)生高度相關(guān),對腫瘤細(xì)胞表面糖基化進(jìn)行特異性成像對腫瘤的早期檢測意義重大。然而,由于糖分子非模板合成和構(gòu)象復(fù)雜的特點(diǎn),以及其傳統(tǒng)靶向分子單一、選擇性不高等缺點(diǎn),難以實(shí)現(xiàn)特異性糖基化檢測�；诖�,本工作采用簡單高效的代謝糖標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記糖分子,并以糖蛋白特異性的新型Aptamer為靶向分子,結(jié)合FRET信號轉(zhuǎn)換機(jī)制,發(fā)展了一種新的細(xì)胞表面蛋白特異性糖基化成像方法。該方法通過代謝糖標(biāo)記技術(shù)在靶糖蛋白上標(biāo)記FRET供體和在Aptamer上標(biāo)記FRET受體,成功實(shí)現(xiàn)了SMMC-7721細(xì)胞表面靶糖蛋白特異性的N-乙酰半乳糖胺化(GalNAcylation)成像。該方法不僅成像對比明顯,而且具有很高的選擇性,為腫瘤細(xì)胞表面糖基化熒光成像分析提供了一種新的思路和方法。四、基于Aptamer引發(fā)的HCR擴(kuò)增用于腫瘤細(xì)胞表面特異性糖基化增強(qiáng)性成像研究糖蛋白一般含有大量的單糖單元,通過代謝糖標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記的FRET供體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其結(jié)合靶向分子上的受體數(shù)量,巨大的受體和供體數(shù)量差異不利于高FRET信號的獲取。針對此問題,本工作結(jié)合HCR擴(kuò)增放大技術(shù),設(shè)計(jì)了一種Aptamer-Trigger嵌合體探針,構(gòu)建了一種Aptamer連接的DNA納米組裝體探針。該納米探針攜帶多個FRET受體基團(tuán),并可通過改變HCR構(gòu)建單元的序列長度使受體基團(tuán)合理分布,與代謝糖標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記的多個FRET供體發(fā)生FRET作用,大大增強(qiáng)了FRET信號。利用該方法成功實(shí)現(xiàn)了SMMC-7721細(xì)胞表面蛋白特異性的GalNAcylation增強(qiáng)成像,相對于非增強(qiáng)性成像方法,其FRET信號增強(qiáng)約兩倍。此外,該方法還具有很好的通用性,不僅可以實(shí)現(xiàn)CCRF-CEM細(xì)胞表面蛋白酪氨酸激酶-7(PTK-7)特異性的唾液酸化(Sialylation)成像,還能夠準(zhǔn)確監(jiān)測藥物處理后PTK-7特異性的Sialylation表達(dá)變化,有望作為一種新的高靈敏分析方法用于腫瘤細(xì)胞表面特異性糖基化檢測。五、轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞Aptamer的篩選及用于轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和組織特異性成像發(fā)展不同靶標(biāo)特異性的Aptamer分子可為腫瘤檢測研究提供更多可供選擇的識別探針。轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生于腫瘤發(fā)生早期階段,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞檢測對腫瘤的早期診斷意義重大。本研究工作利用cell-SELEX技術(shù),以人轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞為正篩細(xì)胞,以人非轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細(xì)胞SW480為負(fù)篩細(xì)胞,篩選獲得了4條能夠高親和力結(jié)合LoVo靶細(xì)胞的Aptamer,其解離平衡常數(shù)(K_d)均在納摩爾級,酶解實(shí)驗(yàn)初步證明這4條Aptamer的靶標(biāo)分子均為蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,其中一條J3 Aptamer不僅能夠識別靶細(xì)胞,還可識別多種轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞。將J3標(biāo)記上Cy5近紅外熒光染料后,成功實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和非轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞之間的對比成像。此外,J3-Cy5還可特異性識別病人轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織,識別率高達(dá)73.9%,而對非轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織和癌旁組織的識別率較低。本工作篩選得到的J3 Aptamer有望作為一種新的分子識別工具用于轉(zhuǎn)移腫瘤的特異性檢測,在腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)警應(yīng)用中具有重要的價值。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.4;O657.3
【圖文】：

博士學(xué)位論文（CT）、磁共振成像（MRI）、超聲成像和核成像等。傳統(tǒng)的影像學(xué)腫瘤檢測方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的無創(chuàng)檢測，提供腫瘤相關(guān)信息，但這些方法的分辯率有限，不能對較小的病灶（厘米級以下）進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測，故不能滿足腫瘤早期檢測的需求。近年來迅猛發(fā)展的分子影像學(xué)檢測方法，可對腫瘤相關(guān)異常分子進(jìn)行特異性成像檢測，其檢測靈敏度相比傳統(tǒng)成像方法有明顯改善，可有效地在分子微觀水平上為腫瘤檢測提供更加全面和精確的信息[15, 16]。結(jié)合傳統(tǒng)的影像學(xué)方法，分子影像檢測方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后判斷。其中，熒光分子成像因其獨(dú)特的優(yōu)勢，在醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最為迅速。例如，Grimm等[17]通過熒光分子斷層成像技術(shù)（FMT），利用鼠肺癌組織過表達(dá)的組織蛋白酶能夠特異性激活光學(xué)探針熒光的特性，實(shí)現(xiàn)了鼠肺腫瘤的 3D 熒光成像，可檢測到直徑為 1 mm 的微小腫瘤（圖 1.1）。

實(shí)現(xiàn)了 CTCs 的高效捕獲與檢測（圖1.2C）。目前，腫瘤標(biāo)志物檢測不僅可用于腫瘤的診斷，還可用于腫瘤的預(yù)后監(jiān)測。由于腫瘤標(biāo)志物是腫瘤在細(xì)胞和分子水平上的異常體現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物可更加準(zhǔn)確、靈敏地預(yù)示腫瘤的早期發(fā)生、發(fā)展過程，因此，腫瘤標(biāo)志物檢測方法在腫瘤的早期診斷領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)勢。目前，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一百余種腫瘤標(biāo)志物，但能夠應(yīng)用于臨床診斷的僅有 20 余種，且理想的臨床腫瘤標(biāo)志物更是微乎其微，因此，需要開發(fā)更多的優(yōu)異腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤檢測。此外，還需發(fā)展高靈敏、高特異性的檢測方法，以實(shí)現(xiàn)微量腫瘤標(biāo)志物的有效檢測。圖 1.2 幾種腫瘤標(biāo)志物檢測方法。（A）電化學(xué)檢測方法[24]；（B）熒光檢測方法[25]；（C）微流控芯片檢測方法[26]。綜上所述，在腫瘤檢測中，傳統(tǒng)的病理學(xué)檢測方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)可以有效地評估腫瘤，但這些方法需要侵入式取樣，給病人帶來痛苦，此外取樣的局限性也限制了腫瘤的準(zhǔn)確診斷；一般的影像學(xué)檢測可以免侵入地在整體上顯示腫瘤的大小和位置等信息，但不能反映具體的腫瘤相關(guān)信息，且檢測靈敏度有待提

amer 及其腫瘤檢測應(yīng)用ptamer 簡介amer（核酸適配體）是指一類能夠高親和、高特異性結(jié)合其靶標(biāo)列，可從化學(xué)合成的 DNA 或 RNA 寡核苷酸文庫（約 1012-101得。Aptamer 及其篩選技術(shù)分別由美國的 Szostak 和 Gold 課題 1990 年，Gold 課題組首先開創(chuàng)了體外篩選技術(shù)，并命名為atic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment），即指數(shù)富[27]。SELEX 的大致流程如下：靶標(biāo)與文庫孵育、去掉未結(jié)合序序列 PCR 擴(kuò)增、單鏈文庫制備、下一輪篩選、克隆測序，篩選以提高篩選效率和特異性（圖 1.3）。幾乎在同時，Szostak 課題篩選技術(shù)，以小分子有機(jī)染料為靶標(biāo)，篩選得到了能夠特異性片段，并根據(jù)拉丁詞“aptus”和希臘詞“meros”把這些片段命名為意[28]。

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本文編號：2758632