【摘要】：發(fā)展高特異性的分子識別探針及高靈敏的分析檢測方法對實現腫瘤的早期診斷、轉移預警和療效評估等具有非常重要的意義。核酸適配體(Aptamer)作為一種新型的能特異識別腫瘤細胞及相關腫瘤標志物的分子識別探針,具備高親和力、高特異性、易合成、易修飾、性質穩(wěn)定、設計靈活等優(yōu)勢,已在腫瘤的分子診斷、靶向治療及相關基礎研究中顯示出獨特優(yōu)勢和重要應用價值。然而,目前常用的基于Aptamer的腫瘤分析檢測往往存在檢測背景高、設計困難和檢測靈敏度不高等缺點;此外,現有的腫瘤細胞特異性Aptamer數量及其靶標信息仍非常有限,嚴重限制了Aptamer的廣泛應用。基于此,本論文針對上述關鍵性問題,以發(fā)展新型腫瘤高靈敏檢測探針和分析方法為目標,采用腫瘤細胞特異性Aptamer,通過引入熒光共振能量轉移(FRET)信號轉換機制和雜交鏈式反應(HCR)放大機制,構建和發(fā)展了一系列低背景、高信號輸出的Aptamer熒光探針和分析方法,系統(tǒng)地開展了腫瘤細胞的高靈敏檢測、腫瘤細胞表面特異性糖基化增強性成像以及轉移腫瘤細胞和組織特異性成像研究。具體研究內容如下:一、基于裂開型Aptamer的發(fā)夾式熒光探針設計及用于腫瘤細胞檢測研究針對常規(guī)Aptamer熒光探針一般依賴于Aptamer整個分子進行設計而導致的序列較長和設計困難等問題,本章基于FRET技術和裂開型Aptamer,設計和發(fā)展了一種發(fā)夾式裂開型Aptamer熒光探針(HSAP)用于腫瘤細胞的靈敏檢測。該探針不僅序列短,且設計簡單方便,背景信號低。以人肝癌SMMC-7721細胞為檢測靶細胞,HSAP可在100μL結合緩沖液中最低檢測到24個細胞,且能夠在50%人血清復雜樣品中實現靶細胞的定量檢測。同時,HSAP具有良好的選擇性,能夠特異性識別混合細胞樣品中的靶細胞。此外,該探針可在15分鐘內實現對靶細胞的一步式檢測,而無需任何洗滌和預處理。這種快速、簡便、靈敏和特異性的腫瘤細胞檢測探針為腫瘤和醫(yī)學診斷研究提供了一種有力的工具。二、基于靶標誘導雙鏈式裂開型Aptamer熒光探針重組裝高靈敏檢測腫瘤細胞研究上述發(fā)夾式Aptamer熒光探針是一種基于分子內FRET模式的檢測探針,雖然靶標結合能夠誘導探針構象變化而產生信號,但由于淬滅基團仍位于探針上,在一定程度上仍有FRET發(fā)生,導致探針熒光不能夠完全恢復。針對此問題,本工作設計了一種基于分子間FRET的雙鏈式裂開型Aptamer熒光探針(DSAP)用于腫瘤細胞高靈敏檢測。在自然狀態(tài)下,DSAP由于發(fā)生FRET,熒光被淬滅;當靶細胞存在時,靶細胞結合誘導DSAP發(fā)生重組裝,使帶淬滅基團的序列從雙鏈探針上解離,從而使熒光完全恢復,產生強烈的熒光信號,大大提高了檢測靈敏度。此外,通過在裂開型探針上分別標記不同的熒光分子,可進一步實現對靶細胞的雙信號檢測,有效地避免假陽性和假陰性信號。該方法簡單、快速、無需洗滌和分離,靈敏度高,檢測信背比高達40倍,可實現對100μL結合緩沖液中7個腫瘤細胞的檢測,并且還進一步實現了含50%人血清復雜樣品和混合細胞的檢測,有望為腫瘤細胞的臨床診斷和研究提供一種新的高靈敏技術和方法。三、基于FRET和代謝糖標記技術的Aptamer導向的腫瘤細胞表面特異性糖基化成像研究異常的細胞表面糖基化通常與腫瘤的早期發(fā)生高度相關,對腫瘤細胞表面糖基化進行特異性成像對腫瘤的早期檢測意義重大。然而,由于糖分子非模板合成和構象復雜的特點,以及其傳統(tǒng)靶向分子單一、選擇性不高等缺點,難以實現特異性糖基化檢測�；诖�,本工作采用簡單高效的代謝糖標記技術標記糖分子,并以糖蛋白特異性的新型Aptamer為靶向分子,結合FRET信號轉換機制,發(fā)展了一種新的細胞表面蛋白特異性糖基化成像方法。該方法通過代謝糖標記技術在靶糖蛋白上標記FRET供體和在Aptamer上標記FRET受體,成功實現了SMMC-7721細胞表面靶糖蛋白特異性的N-乙酰半乳糖胺化(GalNAcylation)成像。該方法不僅成像對比明顯,而且具有很高的選擇性,為腫瘤細胞表面糖基化熒光成像分析提供了一種新的思路和方法。四、基于Aptamer引發(fā)的HCR擴增用于腫瘤細胞表面特異性糖基化增強性成像研究糖蛋白一般含有大量的單糖單元,通過代謝糖標記技術標記的FRET供體數量遠遠高于其結合靶向分子上的受體數量,巨大的受體和供體數量差異不利于高FRET信號的獲取。針對此問題,本工作結合HCR擴增放大技術,設計了一種Aptamer-Trigger嵌合體探針,構建了一種Aptamer連接的DNA納米組裝體探針。該納米探針攜帶多個FRET受體基團,并可通過改變HCR構建單元的序列長度使受體基團合理分布,與代謝糖標記技術標記的多個FRET供體發(fā)生FRET作用,大大增強了FRET信號。利用該方法成功實現了SMMC-7721細胞表面蛋白特異性的GalNAcylation增強成像,相對于非增強性成像方法,其FRET信號增強約兩倍。此外,該方法還具有很好的通用性,不僅可以實現CCRF-CEM細胞表面蛋白酪氨酸激酶-7(PTK-7)特異性的唾液酸化(Sialylation)成像,還能夠準確監(jiān)測藥物處理后PTK-7特異性的Sialylation表達變化,有望作為一種新的高靈敏分析方法用于腫瘤細胞表面特異性糖基化檢測。五、轉移結腸癌LoVo細胞Aptamer的篩選及用于轉移腫瘤細胞和組織特異性成像發(fā)展不同靶標特異性的Aptamer分子可為腫瘤檢測研究提供更多可供選擇的識別探針。轉移腫瘤細胞可產生于腫瘤發(fā)生早期階段,實現轉移腫瘤細胞檢測對腫瘤的早期診斷意義重大。本研究工作利用cell-SELEX技術,以人轉移結腸癌LoVo細胞為正篩細胞,以人非轉移結腸癌細胞SW480為負篩細胞,篩選獲得了4條能夠高親和力結合LoVo靶細胞的Aptamer,其解離平衡常數(K_d)均在納摩爾級,酶解實驗初步證明這4條Aptamer的靶標分子均為蛋白質。實驗結果表明,其中一條J3 Aptamer不僅能夠識別靶細胞,還可識別多種轉移腫瘤細胞。將J3標記上Cy5近紅外熒光染料后,成功實現了轉移腫瘤細胞和非轉移腫瘤細胞之間的對比成像。此外,J3-Cy5還可特異性識別病人轉移結腸癌組織,識別率高達73.9%,而對非轉移結腸癌組織和癌旁組織的識別率較低。本工作篩選得到的J3 Aptamer有望作為一種新的分子識別工具用于轉移腫瘤的特異性檢測,在腫瘤轉移預警應用中具有重要的價值。
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.4;O657.3
【圖文】：

博士學位論文（CT）、磁共振成像（MRI）、超聲成像和核成像等。傳統(tǒng)的影像學腫瘤檢測方法雖然能夠實現腫瘤的無創(chuàng)檢測，提供腫瘤相關信息，但這些方法的分辯率有限，不能對較小的病灶（厘米級以下）進行準確的檢測，故不能滿足腫瘤早期檢測的需求。近年來迅猛發(fā)展的分子影像學檢測方法，可對腫瘤相關異常分子進行特異性成像檢測，其檢測靈敏度相比傳統(tǒng)成像方法有明顯改善，可有效地在分子微觀水平上為腫瘤檢測提供更加全面和精確的信息[15, 16]。結合傳統(tǒng)的影像學方法，分子影像檢測方法已經被廣泛應用于腫瘤的診斷、治療和預后判斷。其中，熒光分子成像因其獨特的優(yōu)勢，在醫(yī)學和生物科學領域中發(fā)展最為迅速。例如，Grimm等[17]通過熒光分子斷層成像技術（FMT），利用鼠肺癌組織過表達的組織蛋白酶能夠特異性激活光學探針熒光的特性，實現了鼠肺腫瘤的 3D 熒光成像，可檢測到直徑為 1 mm 的微小腫瘤（圖 1.1）。

實現了 CTCs 的高效捕獲與檢測（圖1.2C）。目前，腫瘤標志物檢測不僅可用于腫瘤的診斷，還可用于腫瘤的預后監(jiān)測。由于腫瘤標志物是腫瘤在細胞和分子水平上的異常體現，腫瘤標志物可更加準確、靈敏地預示腫瘤的早期發(fā)生、發(fā)展過程，因此，腫瘤標志物檢測方法在腫瘤的早期診斷領域具有明顯的優(yōu)勢。目前，雖然已經發(fā)現了一百余種腫瘤標志物，但能夠應用于臨床診斷的僅有 20 余種，且理想的臨床腫瘤標志物更是微乎其微，因此，需要開發(fā)更多的優(yōu)異腫瘤標志物用于腫瘤檢測。此外，還需發(fā)展高靈敏、高特異性的檢測方法，以實現微量腫瘤標志物的有效檢測。圖 1.2 幾種腫瘤標志物檢測方法。（A）電化學檢測方法[24]；（B）熒光檢測方法[25]；（C）微流控芯片檢測方法[26]。綜上所述，在腫瘤檢測中，傳統(tǒng)的病理學檢測方法結合分子生物學技術可以有效地評估腫瘤，但這些方法需要侵入式取樣，給病人帶來痛苦，此外取樣的局限性也限制了腫瘤的準確診斷；一般的影像學檢測可以免侵入地在整體上顯示腫瘤的大小和位置等信息，但不能反映具體的腫瘤相關信息，且檢測靈敏度有待提

amer 及其腫瘤檢測應用ptamer 簡介amer（核酸適配體）是指一類能夠高親和、高特異性結合其靶標列，可從化學合成的 DNA 或 RNA 寡核苷酸文庫（約 1012-101得。Aptamer 及其篩選技術分別由美國的 Szostak 和 Gold 課題 1990 年，Gold 課題組首先開創(chuàng)了體外篩選技術，并命名為atic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment），即指數富[27]。SELEX 的大致流程如下：靶標與文庫孵育、去掉未結合序序列 PCR 擴增、單鏈文庫制備、下一輪篩選、克隆測序，篩選以提高篩選效率和特異性（圖 1.3）。幾乎在同時，Szostak 課題篩選技術，以小分子有機染料為靶標，篩選得到了能夠特異性片段，并根據拉丁詞“aptus”和希臘詞“meros”把這些片段命名為意[28]。

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本文編號：2758632