【摘要】：背景肺癌為近年來在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高居第一位的惡性疾病,且為男、女性腫瘤致死的首要原因。由于肺臟為人體唯一暴露在外界環(huán)境下的內(nèi)臟器官,居多證據(jù)證明肺癌的發(fā)生是在內(nèi)源環(huán)境與外界因素的共同作用下多因素,多基因參與的演變過程。盡管肺癌在臨床上十分常見,迄今為止尚未有明確的結論解釋肺癌發(fā)病的分子機制。端粒是位于真核生物染色體末端長度約為8-20kb的重復序列DNA(TTAGGG)n及相關蛋白組成,主要功能包括保護染色體末端免于融合與降解、并且參與染色體的定位、復制。細胞中維持端粒長度的最主要途徑是由端粒酶介導的。端粒酶是由蛋白質與RNA組成的具有逆轉錄酶活性的核糖核蛋白,具有維持染色體穩(wěn)定性和完整性的作用,從而保證細胞的正常增殖。目前認為端粒酶的核心部件為端粒酶逆轉錄酶(TERT,telomerase reverse transcriptase),該酶為維持端粒酶活性的最主要核心物質。TERT啟動子區(qū)基因的多樣性可改變TERT的表達水平,該啟動子區(qū)轉錄起始位點上游360bp內(nèi)的突變可形成Ets/TCF結合序列,對于Ets轉錄因子家族蛋白具有較高的結合親性,從而增加TERT的轉錄水平。ETV4是Ets轉錄因子家族成員中多瘤病毒增強子3基因(PEA3,Polymoma virus enhancer-3)的成員之一,該因子過表達可導致正常細胞發(fā)生惡變,從而增強腫瘤細胞的侵襲與轉移能力,但該基因作為Ets家族轉錄因子對于肺癌的作用尚未了解透徹第一部分:端粒酶逆轉錄酶啟動子區(qū)多樣性在非小細胞肺癌中的研究研究目的:探討在非小細胞肺癌(NSCLC,Non-small Cell Lung Cancer)患者腫瘤中TERT啟動子突變以及位于啟動子區(qū)域中rs2853669單核苷酸多態(tài)性(SNP,Single Nucleotide Polymorphisms)對TERT mRNA表達及端粒長度的影響,同時分析TERT啟動子序列的多樣性與表皮生長因子受體(EGFR,Epidermal Growth Factor Receptor)突變的交互作用對TERT mRNA的表達、端粒序列長度以及患者預后的關系。研究方法:1.用聚合酶鏈式反應(PCR,Polymerase Chain Reaction)對患者腫瘤組織中TERT啟動子區(qū)以及EGFR第18,19,20,21外顯子進行擴增,用Sanger測序法對擴增產(chǎn)物進行測序。2.采用熒光定量PCR檢測患者腫瘤組織中TERT mRNA的表達水平,用單色多重熒光定量(MMQPCR,Monochrome multiplex quantitative PCR)檢測患者腫瘤細胞中的相對端粒長度。3.建立數(shù)學模型分析啟動子區(qū)的多樣性與端粒酶逆轉錄酶表達水平和端粒序列長度的關系,并探索分析端粒酶啟動子多樣性在表皮生長因子受體突變的情況下對端粒酶逆轉錄酶與端粒序列長度的關系、端粒序列長度以及患者生存的影響。結果:1.TERT啟動子區(qū)多樣性檢出率250例患者中有11例患者(4.4%)攜帶經(jīng)典TERT啟動子區(qū)變異。其中包括距離轉錄起始位點-146位置突變(-146CT)4例,距離起始位點-124位置突變(-124CG)2例。此外還包括-166-167CCAA突變兩例,-189GA突變兩例,-173+C—例。與端粒酶啟動子區(qū)未發(fā)生突變的患者相比,產(chǎn)生突變患者的TERT mRNA表達水平較高(P=0.021),且腫瘤組織細胞中相對端粒長度較長(P=0.039)。2.SNPrs2853669的分布情況與臨床特征比較在所檢測的250例患者中,共有142名患者攜帶rs2853669 SNP,其中包括雜合子T/C序列攜帶者106名,純合子C/C序列攜帶者36名。另外108名患者為非rs2853669SNP攜帶者(T/T)。rs2853669 SNP組間比較顯示T/T攜帶者腫瘤最大長徑較大(P=0.025)且多數(shù)屬于T分期較為晚期的腫瘤(P=0.011)。分析顯示攜帶T/T的腫瘤細胞中TERTmRNA表達水平較高(P=0.005)。3.rs2853669 SNP與EGFR突變的關系T/C攜帶者EGFR突變產(chǎn)生比率較高(37.7%)(P=0.003)。C/C攜帶者EGFR突變率最低(16.7%)。其中第19外顯子,20外顯子突變在T/C攜帶者中的突變率最高(P=0.033)。4.EGFR突變與rs2853669對TERT mRNA與相對端粒序列長度的影響T/C攜帶者的病理標本中TERTmRNA表達量最高,其次為T/T攜帶者(Pc/c Vs.T/C0.01,PC/CVS.T/T=0.043)。在EGFR未突變的情況下該差異的統(tǒng)計功效更為明顯 P C/C Vs.T/C0.001,PC/c Vs.T/T=0.032)。在EGFR突變的情況下,只有T/C序列攜帶者的端粒酶逆轉錄酶mRNA表達量高于T/T序列攜帶者(P=0.023)。雜合子T/C序列攜帶者腫瘤中相對端粒長度最長但差別未能達到統(tǒng)計學意義(PT/C VS.T/T=0.052,PT/C vs.c/c=0.071)。然而該差異在EGFR未突變的患者中具有統(tǒng)計學意義(PT/C VS.T/T=0.039,PT/C VS.C/C=0.039)。5.EGFR突變與rs2853669 SNP的交互關系對NSCLC患者生存的影響攜帶雜合子T/C與純合子T/T,C/C的NSCLC患者的生存期中位數(shù)分別為(64.74+3.1)月,(80.02+2.4)月與(76.3+2.4)月,且存在顯著性差異(P=0.001),無病生存期分別為(65.7+3.1)月,(81.3+2.4)月與(74.9+2.8)月,同樣存在顯著性差異(P=0.027)。且這種差異只會出現(xiàn)在EGFR為發(fā)生突變的患者組中。在EGFR突變的患者中,總生存期與無病生存期未出現(xiàn)顯著性差異。結論:1.TERT啟動子突變與rs2853669 SNP可調節(jié)端粒酶逆轉錄酶mRNA的表達并且對相對端粒長度有影響。2.TERT啟動子突變與rs2853669 SNP可影響NSCLC患者的總生存率與無病生存率。3.rs2853669SNP對端粒生物學的調節(jié)受患者EGFR突變狀態(tài)的影響。第二部分:ETV4蛋白下調抑制非小細胞肺癌增殖機制的研究研究目的:采用熒光定量PCR檢測NSCLC患者癌與癌旁組織標本中ETV4的表達水平,在體外實驗中下調非小細胞肺癌細胞系中ETV4的表達,觀察細胞的增殖情況,并對可能的分子機制進行探索研究。研究方法:1.用定量PCR分析76名非小細胞肺癌患者癌與癌旁組織中ETV4的表達差異,以及TERT啟動子突變與rs2853669對ETV4表達的影響。2.人為下調NSCLC細胞系中ETV4的表達,觀察其對細胞系增殖與TERT的影響。3.體用蛋白質印記技術、流式細胞儀探究ETV4下調抑制細胞增殖的機制結果:1.癌組織與癌旁組織相比ETV4表達量較高(P=0.001),攜帶TERT啟動子突變的患者ETV4表達量相對較高(P=0.08),攜帶rs2853669 TC(P0.01)與TT(P=0.072)等位基因的患者ETV4表達量較高。2.下調H661,HCC827與A549細胞系中ETV4表達后細胞增殖受到抑制且導致G0/1期細胞周期阻滯;下調ETV4后H661與A549細胞中cyclinD1、cyclinD3、CDK4余P21蛋白以及磷酸化erk有所下調(P0.05)。3.下調H661與HCC827細胞中ETV4表達后TERT的表達也有所下調(P0.05);在A549細胞中沉默ETV4后可下調AP-1家族蛋白LEF-1、β-caterin與J-Jun的表達水平。結論:1.非小細胞肺癌組織相對癌旁組織ETV4表達量顯著升高。TERT啟動子突變攜帶者與rs2853669 SNP TC與TT等位基因攜帶者呈高表達ETV4。高ETV4與較大的腫瘤最大長徑與淋巴結轉移有統(tǒng)計學相關意義。2.體外實驗表明下調ETV4的表達水平可通過引起G1/G0期細胞周期阻滯,該周期阻滯可能是由激活erk通路對周期蛋白相關底物進行去磷酸化而導致的。3.下調ETV4的表達水平可同時下調AP-1轉錄家族基因,提示在非小細胞肺癌中,Ets轉錄家族ETV4與AP-1轉錄家族基因之間存在相互調節(jié)作用,從而對TERT的表達可能存在共性調節(jié)作用。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

動子的突變與ｒｓ２８５３６６９等位基因表型。其中包括１４９名男性患者，１０１名女性患逡逑者。患者的平均年齡為６０．邋３邋±１０歲（表１）。結果顯示共有１１例患者（４．４％）攜逡逑帶ＴＥＲＴ啟動子突變（表２，圖１）．包括６例肺腺癌患者與５例肺鱗癌患者，這些逡逑突變包括２例－１４６邋Ｃ＞Ｇ突變，４例－１２４邋Ｃ＞Ｔ突變，３例－１８９Ｇ＞Ａ突變與２例逡逑－１６７，－１６６，ＣＣ＞ＡＡ突變。ＴＥＲＴ啟動子肺腺癌中的突變率為（６／１６３，邋３．邋７％），在肺鱗逡逑癌中的突變率為５．邋７％邋（５／８７）。逡逑邐表１邋２５０名ＮＳＣＬＣ患者基礎臨床信息邐逡逑ＴＥＲＴ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋Ｓｔａｔｕｓ逡逑Ｍｕｔａｔｅｄ邐ＷＴ逡逑￣Ｎｏ￣％￣邋＂ｌ＾ｏ￣Ｐ逡逑Ａｌｌ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邐Ｕ￣４Ａ邐２３８邋９５．６逡逑Ａｇｅ邋ａｔ邋ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，邋ｙｅａｒｓ邋６２．５邋±邋７．９邐６０．５邐±邋９．７邐０．５９９逡逑Ｓｅｘ，邋ｍａｌｅ邐７邐５８．３邐１４２邐５９．７邐０．７８０逡逑Ｓｍｏｋｅ邐４邐３３．３邐４９邐２０．６邐０．２０８逡逑Ｄｒｉｎｋ邐２邐１６．７邐４２邐１７．６邐０．９５９逡逑表２：邐１１例攜帶ＴＥＲＴ啟動子點突變患者信息逡逑ＩＤ邐ＴＥＲＴ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邐Ｔｕｍｏｒ邋ｓｉｚｅ邋Ｎ邋Ｔ邐ＴＮＭ逡逑ｎｕｍｂｅｒ邐Ａｇｅ邐Ｇｅｎｄｅｒ邐Ｍｕｔａｉｏｎ邐Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ邐（ｃｍ）邐ｓｔａｇｅ邐ｓｔａｇｅ邐Ｇｒａｄｅ邐ｓｔａｇｅ逡逑￣５邐７１邐Ｍａｌｅ邐－１８９Ｇ＞Ａ邐ＳＣＣ邐９ｌ邐０邐４邐ｉ邐ＩＩＩＡ逡逑６邐６５邐Ｆｅｍａｌｅ邐－１６７

動子點突變與腫瘤大小、類型、分化程度、浸潤事件、ＴＮＭ分期并無相關性，但攜逡逑帶ＴＥＲＴ啟動子突變患者的ＴＥＲＴ邋ｍＲＮＡ表達水平高于未發(fā)生突變的患者（－１３．１７逡逑±ｌ．ｌｖｓ．－１４．５±１．８．Ｐ＝０．０２１）（表３，圖２）。且相對端粒長度也大于未攜帶突變逡逑的患者（丨．０５±０．３５邋ｖｓ．０．８６±０．３，Ｐ＝０．０３９，表３，圖２）。隨后我們分別分析了肺逡逑腺癌與肺鱗癌患者中ＴＥＲＴ啟動子突變與臨床信息之間的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)只有在肺逡逑腺癌中

１．邋４邋ｒｓ２８５３６６９邋ＳＮＰ不同等位基因在非小細胞肺癌的分布。逡逑我們擴增的啟動子區(qū)包括了位于起始位點上游－２４５ｂｐ位點的－２８５３６６９邋ＳＮＰ。逡逑其中包括純合子等位基因Ｔ／Ｔ邋（野型），Ｃ／Ｃ與雜合子Ｔ／Ｃ（變異型）。其中Ｔ／Ｔ與逡逑Ｔ／Ｃ的攜帶者分別為１０８邋（邋４３．２％）名患者與１０６邋（邋４２＿邋４％）名患者。Ｃ／Ｃ等位基因逡逑攜帶者為３６邋（１４．邋４％）名。Ｔ／Ｔ等位基因攜帶者中有６２邋（邋５７．邋４％）名肺腺癌患者，逡逑４６邋（邋４２．邋６％）名肺淲癌患者。Ｔ／Ｃ等位基因攜帶者中有７４邋（邋６９．邋８？／４）例肺腺癌患者，逡逑３２邋（邋３０．邋１％）名肺鱗癌患者。Ｃ／Ｃ等位基因攜帶者中有２７邋（７５％）名肺腺癌患者，逡逑９（２５％）名肺淲癌患者。逡逑１．邋５邋ｒｓ２８５３６６９邋ＳＮＰ不同等位基因與ＮＳＣＬＣ患者臨床信息相關性分析逡逑我們分析了邋ｒｓ２８５３６６９不同等位基因與患者臨床信息之間是否具有相關性。結逡逑果見表４。分析結果顯示，在所有患者中，ｒｓ２８５３６６９與患者的年齡，性別無相關逡逑性。Ｔ／Ｔ攜帶的腫瘤最大長徑最大（Ｔ／Ｔ：邋Ｔ／Ｃ：邋Ｃ／Ｃ邋＝邋３．５邋士邋１．邋８：邋３．邋０邋±邋１．５２：逡逑２．９邋±邋１．１５，邋Ｐ＝０．邋０２５邋）（表４），且與另外兩個等位基因相比，歸類于中央型肺逡逑

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