【摘要】：放射治療是當今腫瘤治療的三大手段之一,在病人術(shù)前或是術(shù)后放療可以有效治愈腫瘤,減少腫瘤復發(fā)概率。但是腹部和盆腔腫瘤在放射治療過程中,放射性腸損傷是一重要的臨床問題。放射性腸損傷是由于腸上皮放射敏感性較高,受照小腸或是結(jié)直腸損傷誘發(fā)的腸道反應,常常會出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉和營養(yǎng)吸收障礙,體重下降,甚至出現(xiàn)便血、腸梗阻、腸簍等病變,嚴重影響病人的生活質(zhì)量,不利于放療對腹盆腔腫瘤的控制。哺乳類動物腸上皮是由單層柱狀上皮組成,主要分為兩個不同部分:分化區(qū)和增生區(qū),分化的上皮細胞主要存在于絨毛和上皮表面,增生上皮細胞主要位于隱窩,可以進一步的分為干細胞和TA細胞,TA細胞具有快速分化并轉(zhuǎn)移到增生區(qū),干細胞又能及時補充TA細胞,因此在增生區(qū)連續(xù)不斷地分化會導致上皮細胞沿隱窩-絨毛軸方向移動,逐漸移動到分化區(qū),并使上皮細胞分化為吸收細胞系(腸細胞)和分泌細胞系(杯狀細胞和內(nèi)分泌細胞)。所以認為腸上皮是由四種腸道上皮細胞系組成,它們都起源于干細胞,并且位于隱窩基底部的干細胞在維持腸上皮平衡起到重要作用1-2。像是腸道感染、放射損傷和特發(fā)性腸炎等各種各樣疾病引起的腸上皮損傷就會造成上皮細胞的凋亡、上皮屏障的破壞3。上皮層受到損傷,就會逐步激活再生程序,隱窩干細胞增殖,并移動到分化區(qū),使上皮層恢復連續(xù)緊密的結(jié)構(gòu)4。那么分化區(qū)凋亡的上皮距離隱窩干細胞甚遠,如何及時通知到干細胞呢?巨噬細胞是固有免疫系統(tǒng)的組成部分,在體內(nèi)最大的巨噬細胞群之一就是腸道巨噬細胞5,它們位于上皮屏障下方,參與腸道的免疫應答,但目前原代培養(yǎng)存在困難。Tanja等認為巨噬細胞這種免疫應答激活不僅僅是由于外來物質(zhì)的刺激,還有上皮參與,所以他們進行了巨噬細胞與上皮細胞的共培養(yǎng),但是在共培養(yǎng)的第7天發(fā)現(xiàn)只有少量巨噬細胞存活;Hiroki等人研究巨噬細胞與上皮細胞之間相互傳遞信號的機制,試通過體外培養(yǎng)Caco-2與THP-1,并沒有首選體內(nèi)腸巨噬細胞。成熟的巨噬細胞在主要是來源于骨髓,隨著外周血液循環(huán)到達組織,組織的微環(huán)境可使巨噬細胞發(fā)生極化。目前巨噬細胞極化類型主要分為兩種:M1型主要是參與免疫應答,吞噬有害微生物等,產(chǎn)生炎癥因子IL-6、NO等,提高機體的防御,抵御有害物質(zhì)侵襲;M2型主要是在損傷組織中通過分泌抗炎因子參與修復與重塑,減輕機體炎癥反應。鑒于此,本論文首先對腸道自身的巨噬細胞進行了極型鑒定,在體外模擬凋亡腸道上皮細胞誘導Raw264.7細胞極化,探索這種巨噬細胞對隱窩腸道干細胞的作用和機制,為放射損傷的小腸修復提供理論依據(jù)。一、小鼠小腸內(nèi)巨噬細胞極型和在放射損傷中的作用目的:腸道巨噬細胞在放射損傷中的作用方法:通過對對照組和2Gy、8Gy照射組照后72小時和96小時C57BL/6小鼠腸細胞的分離及利用流式細胞分選技術(shù),得到小鼠腸道巨噬細胞;對小鼠腸道巨噬細胞抽提RNA,以IL-10和i NOS基因作為分型標志物,進行實時熒光定量PCR檢測,以確定照射前后巨噬細胞極型;正常C57BL/6小鼠在第1天、5天、7天和9天分別經(jīng)腹腔注射200μl Clodronate脂質(zhì)體、PBS脂質(zhì)體部分祛除小鼠腸道巨噬細胞,第8天和第11天進行流式細胞術(shù)分析小鼠胸腺、淋巴、腸道、脾臟、骨髓CD68+細胞選取最佳祛除巨噬細胞的時間點;對照組與照射組小鼠均分別給予Clodronate脂質(zhì)體和PBS脂質(zhì)體,第8天小鼠進行8Gy的全身照射并在照后72小時、96小時采腸道標本,進行CD68、Claudin5免疫組織化學染色、HE染色、腸上皮核間距分析觀察小鼠腸道的放射損傷情況。結(jié)果:對照組小鼠腸道巨噬細胞百分數(shù)是59.2%、60.6%、60.3%,2Gy照后72小時細胞百分數(shù)25.8%、33.7%、30.8%,巨噬細胞開始下降;96小時細胞百分數(shù)49.9%、44%、42.1%,逐漸恢復;8Gy照后72小時細胞百分數(shù)40.9%、36%、42.9%,96小時細胞百分數(shù)40.2%、40.5%、39.3%,未見明顯恢復;RT-PCR結(jié)果表明對照組和照射組小鼠腸道的巨噬細胞均存在M2型巨噬細胞;小鼠腹腔注射Clodronate脂質(zhì)體和PBS,發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)胸腺、淋巴、腸道、脾臟、骨髓細胞巨噬細胞在給藥后的第8天CD68陽性細胞數(shù)量開始下降,在第11天進一步下降,后期恢復到第8天水平,因此選取給藥后第11天作為祛除小鼠體內(nèi)巨噬細胞效果最佳時間點;病理分析顯示在給予小鼠8Gy照射后,巨噬細胞減少的小鼠腸道損傷較對照組更為明顯;核間距分析結(jié)果表明8Gy照射后72h對照組上皮細胞核排列較對照組排列較為紊亂,Clodronate脂質(zhì)體組上皮細胞核排列更加紊亂,核間距增大,出現(xiàn)核固縮壞死;96h對照組上皮逐漸開始恢復,增生,核排列較72 h緊密,形態(tài)相對完整,96h Clodronate脂質(zhì)體組上皮損傷更為嚴重,核間距進一步增加;Claudin5結(jié)果顯示8Gy照射后72h對照組與Clodronate脂質(zhì)體組均存在部分屏障損傷,未見明顯差異,96h對照組部分損傷,Clodronate脂質(zhì)體組腸道組織大體存在明顯損傷,其損傷程度明顯高于對照組。結(jié)論:在小鼠腸道內(nèi)巨噬細胞是以M2型存在,而且在照射后極型不改變,并在腸道放射性損傷中起保護作用。二、體外誘導M2巨噬細胞促進Lgr5腸道干細胞增殖目的:腸道巨噬細胞發(fā)揮作用的機制方法:對CT26小鼠結(jié)腸癌細胞進行6Gy和15Gy照射并用流式細胞儀通過磷脂酰絲氨酸外翻法檢測細胞凋亡;用凋亡細胞上清液對RAW264.7小鼠巨噬細胞細胞進行體外極化誘導分型,通過Elisa分析IL-10與IL-12的變化確定細胞體外極化誘導后的極型;利用Lgr5-EGFP-IRES-cre ERT2小鼠進行Lgr5腸道干細胞的分離與培養(yǎng);將體外誘導極化的RAW264.7巨噬細胞與Lgr5腸道干細胞進行細胞共培養(yǎng)或Transwell培養(yǎng),通過多功能酶標儀檢測GFP熒光強度。結(jié)果:CT26細胞在15Gy照射條件下在72小時凋亡細胞率達到66.9%;RAW264.7細胞在凋亡上清液的作用三天后細胞IL-10表達上調(diào)以及IL-12表達下調(diào),證實RAW264.7發(fā)生極化成為M2型巨噬細胞;Lgr5+腸道干細胞在分別缺少Noggin、EGF、R-spondin干細胞生長因子的條件下與對照組RAW264.7、M2型RAW264.7分別共培養(yǎng),表明M2型巨噬細胞可以分泌EGF因子,代替培養(yǎng)基中的EGF,促進干細胞的生長增殖。結(jié)論:M2型巨噬細胞通過分泌EGF促進Lgr5+腸道隱窩干細胞的生長增殖。綜上所述表明腸道中存在M2型巨噬細胞,這種極型不因照射而改變,并且通過分泌EGF因子,促進腸道隱窩干細胞Lgr5生長增殖。腸道中M2型巨噬細胞的缺失會導致腸道放射損傷修復的延緩。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.55
【圖文】：

圖 1.2 小鼠腸道巨噬細胞 real time-PCR IL-10/inos 相對表達量 *代表 p<0.05,每小組的小鼠數(shù)量 2 只合成為一個樣,總共 5 小組,real time-PCR n=4 。2、小鼠腸道巨噬細胞的作用如圖 1.3 所示，小鼠的脾臟、淋巴、腸道、骨髓、胸腺細胞，經(jīng)流式細胞儀分析，得出小鼠體內(nèi)巨噬細胞開始下降，并且 Clodronate 脂質(zhì)體組小鼠的脾臟、腸道、骨髓、胸腺中的巨噬細胞分別從第8天的7.91%下降到第11天的6.91%，4.37%下降到1.52%，30.30%下降到 17.27%，14.06%下降到 0.98%均有顯著的統(tǒng)計學差異（P<0.05）。由此流式結(jié)果得出小鼠給予 PBS 脂質(zhì)體、Clodronate 脂質(zhì)體后的第 11 天體內(nèi)巨噬細胞下降較為明顯，確定祛除小鼠體內(nèi)巨噬細胞的最佳時間點。

圖 1.3 小鼠給予 PBS 脂質(zhì)體、Clodronate 脂質(zhì)體 1、5、7、9 天，體內(nèi)巨噬細胞百分數(shù)，a.小鼠處理后第 8 天各器官巨噬細胞百分數(shù) b.小鼠處理后第 11 天各器官巨噬細胞百分數(shù) n=4如圖 1.4 所示，對照組與 8Gy 照射組（PBS 脂質(zhì)體、Clodronate 脂質(zhì)體處理后第8 天照射）在第 11 天小鼠腸道 CD68 免疫組織化學染色，結(jié)果示小鼠腸道 CD68 陽性細胞數(shù)量下降，并有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

14圖 1.4 PBS 脂質(zhì)體、Clodronate 脂質(zhì)體處理后小鼠腸道 CD68 陽性細胞數(shù)，每一小組數(shù)量為 6 只。A.照射組 PBS 脂質(zhì)體、Clodronate 脂質(zhì)體處理后 CD68 變化圖。B. 對照組 PBS 脂質(zhì)體、Clodronate 脂質(zhì)體處理后 CD68 變化圖 （*代表 P<0.05 ，免組圖400X)如圖 1.5 所示 小鼠在 PBS 脂質(zhì)體、Clodronate 脂質(zhì)體處理后，在給予 8Gy 照射下腸道病理形態(tài)的改變，結(jié)果所示為：a. PBS 脂質(zhì)體、Clodronate 脂質(zhì)體組均無損傷 b.PBS 脂質(zhì)體間質(zhì)充血，粘液分泌細胞存在， 隱窩細胞好，Clodronate 脂質(zhì)體上皮差，

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本文編號：2756360