【摘要】：研究目的:腎透明細(xì)胞癌(Clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是一種發(fā)病率非常高的泌尿系統(tǒng)疾病,其發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)癌癥中僅次于膀胱癌。在我國(guó),ccRCC的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年快速上升趨勢(shì)。目前對(duì)ccRCC發(fā)病機(jī)制的了解尚不完全清晰,因此需要深入研究ccRCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,為該疾病的治療提供新的靶標(biāo)分子。微小RNA-543(microRNA-543,miR-543)在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常,miR-543可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Krupple樣因子6(Krupple-like factor 6,KLF6)是一個(gè)與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)的基因。研究表明,KLF6在ccRCC中異常表達(dá),參與ccRCC的發(fā)生和進(jìn)展過程。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析顯示,KLF6 mRNA的3’-非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)具有和miR-543的結(jié)合位點(diǎn)。但是,miR-543是否通過靶向結(jié)合KLF6 mRNA 3’-UTR來調(diào)控KLF6的表達(dá),并參與ccRCC的發(fā)生和進(jìn)展,目前還沒有相關(guān)研究。本研究主要分析miR-543在ccRCC組織和細(xì)胞中表達(dá)水平,并研究miR-543對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖和侵襲等生物學(xué)特征的調(diào)控作用;另外,闡明miR-543對(duì)KLF6的調(diào)控作用及其對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖和侵襲的相關(guān)調(diào)控分子機(jī)制;為闡明ccRCC的發(fā)病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ),并為ccRCC的藥物研發(fā)和臨床治療提供新的靶標(biāo)分子。研究方法:1.利用RT-qPCR方法檢測(cè)miR-543在ccRCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平;利用miR-543 mimics和miR-543 inhibitor轉(zhuǎn)染ccRCC細(xì)胞進(jìn)行miR-543的過表達(dá)或抑制表達(dá);利用CCK-8和流式細(xì)胞方法檢測(cè)miR-543對(duì)ccRCC細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響,細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-543對(duì)ccRCC細(xì)胞侵襲的影響;2.利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因方法研究miR-543和KLF6mRNA 3’-UTR的靶向結(jié)合作用;利用RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)miR-543對(duì)KLF6和p21的表達(dá)水平的調(diào)控作用;利用斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)分析方法分析ccRCC組織中miR-543與KLF6表達(dá)水平的相關(guān)性;3.利用miR-543 mimics和KLF6表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染或miR-543 inhibitor和KLF6siRNA共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來明確miR-543和KLF6之間的功能調(diào)控關(guān)系。研究結(jié)果:1.在ccRCC組織和細(xì)胞系中,miR-543的表達(dá)水平顯著上升;過表達(dá)miR-543可以促進(jìn)ccRCC細(xì)胞的增殖和侵襲,降低G0/G1期細(xì)胞比例和細(xì)胞凋亡率;抑制miR-543的表達(dá)則呈現(xiàn)相反的作用;2.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示,KLF6 3’-UTR具有miR-543的靶向結(jié)合序列,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),miR-543可以直接靶向結(jié)合KLF6 3’-UTR;過表達(dá)miR-543抑制KLF6的表達(dá),而抑制miR-543則促進(jìn)KLF6的表達(dá);另外,在ccRCC組織中,miR-543與KLF6表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性;miR-543可以通過調(diào)控KLF6的表達(dá)來調(diào)控p21的表達(dá);3.KLF6過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-543過表達(dá)對(duì)ccRCC細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控作用;而沉默KLF6則可以逆轉(zhuǎn)miR-543表達(dá)抑制對(duì)ccRCC細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控作用。研究結(jié)論:miR-543在ccRCC組織和細(xì)胞中高表達(dá),可能發(fā)揮致癌基因的作用,促進(jìn)ccRCC細(xì)胞的增殖和侵襲,可以靶向結(jié)合KLF6 3’-UTR并抑制KLF6的表達(dá),通過靶向調(diào)控KLF6的表達(dá)來調(diào)控p21的表達(dá),通過靶向調(diào)控KLF6的表達(dá)來調(diào)控ccRCC細(xì)胞的增殖和侵襲,從而參與ccRCC的發(fā)生和進(jìn)展,為闡明ccRCC的分子發(fā)病機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ),并為ccRCC的藥物研發(fā)和臨床治療提供了新的可參考的靶標(biāo)分子。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.11
【圖文】：

miRNA 在癌癥發(fā)生過程中可能發(fā)揮促癌作用，導(dǎo)致機(jī)體癌癥及持續(xù)惡化，能發(fā)揮抑癌作用，保證機(jī)體細(xì)胞處于正常生長(zhǎng)狀態(tài)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-5多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，如在結(jié)直腸癌中，miR-543 表達(dá)明顯下調(diào)，但尚未有報(bào)道 miR-543 在 ccRCC 細(xì)胞中的表達(dá)模式，因此本研究對(duì) miR-543 在該腫瘤細(xì)的表達(dá)變化進(jìn)行研究分析。首先利用 RT-qPCR 方法檢測(cè)了 20 例 ccRCC 患者組其癌旁組織（對(duì)照組）中 miR-543 的表達(dá)變化，結(jié)果顯示（圖 1-1A），ccRCC中 miR-543 的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P<0.001）；隨后檢測(cè)了多種 ccR胞系（786-O、A-498、Caki-1 和 Caki-2）中 miR-543 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示（-1B），與正常腎臟細(xì)胞系 HK-2 相比，miR-543 在 786-O、A-498、Caki-1 和 Cak四種細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05），其中 miR-543 在 786-O 和 Cak胞系中的表達(dá)高于另外兩種 ccRCC 細(xì)胞系，因此選擇 786-O 和 Caki-2 細(xì)胞系進(jìn)入研究。該研究表明，在 ccRCC 發(fā)展過程中，miR-543 在 ccRCC 組織及細(xì)胞系表達(dá)水平顯著上升，miR-543 的表達(dá)與 ccRCC 的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)性。

miR-543 的表達(dá)水平與癌癥的病發(fā)可能呈正相關(guān)。在人體內(nèi)或體外培養(yǎng)，癌細(xì)胞都具有快速并無限增殖特征，因癌細(xì)胞增殖失去機(jī)體調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤不斷惡性生長(zhǎng)。因此本論文研究分析了 miR-543 在 ccRCC 細(xì)胞增殖過程中的調(diào)控作用，利用 NC、miR-543 mimics 或 miR-543 inhibitor 分別轉(zhuǎn)染 786-O 和 Caki-2 細(xì)胞。首先利用RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 miR-543 的表達(dá)水平，結(jié)果表明（圖 1-2A），與 NC 轉(zhuǎn)染組相比，miR-543 mimics 轉(zhuǎn)染組，miR-534 在兩細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯上升（P<0.01），而在 miR-543 inhibitor 轉(zhuǎn)染組中，miR-543 在兩細(xì)胞系中的表達(dá)水平則顯著下降（P<0.05）。利用 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖變化，結(jié)果表明（圖 1-2B），與 NC 轉(zhuǎn)染組相比，miR-543 mimics 轉(zhuǎn)染后，兩細(xì)胞系的增殖能力顯著增強(qiáng)（P<0.05），而當(dāng) miR-543 inhibitor 轉(zhuǎn)染后，兩細(xì)胞系的增殖能力則明顯減弱（P<0.05）。該研究結(jié)果表明，miR-543 可促進(jìn) ccRCC 細(xì)胞的增殖，miR-543 表達(dá)水平上升時(shí)，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；而 miR-543 表達(dá)水平下降時(shí)，細(xì)胞的增殖能力減弱。

-543 overexpresison or suppression on 786-O or Caki-2 -8 assay.*P<0.05,**P<0.01 compared with NC.cRCC 細(xì)胞細(xì)胞周期的影響過程，機(jī)體對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控具有非常重要的作用由 G0 向 G1 期轉(zhuǎn)變過程處于非常關(guān)鍵的調(diào)控位置細(xì)胞周期的調(diào)控，從而加速 G0 期細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?G1 NC、miR-543 mimics 或 miR-543 inhibitor 分別轉(zhuǎn) G0 期和 G1 期的細(xì)胞比例，研究分析 miR-543 對(duì)3），與 NC 轉(zhuǎn)染組相比，miR-543 mimics 轉(zhuǎn)染組細(xì)），而 miR-543 inhibitor 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞 G0/G1 比例明，miR-543 可以促進(jìn) ccRCC 細(xì)胞由 G0 期向 G1 期543 表達(dá)沉默會(huì)引起 ccRCC 細(xì)胞由 G0 期向 G1 期

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 蔡曉沂;鐘鎬鎬;王秀艷;吳秉銓;;快速、準(zhǔn)確的B族鏈球菌檢測(cè)——即時(shí)熒光探針核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年13期

本文編號(hào)：2755013