【摘要】：研究目的及意義:惡性腫瘤是威脅人類健康與生命的最為嚴(yán)重的疾病之一,免疫治療是區(qū)別于傳統(tǒng)治療方法(手術(shù)及放、化療)的另一種最具有研究前景的腫瘤治療方法。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是機(jī)體中重要的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells,APCs),DCs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系,在誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫過(guò)程中扮演著重要的角色。它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原。DCs被認(rèn)為是目前已發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的APCs。體內(nèi)抗腫瘤免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫,其中細(xì)胞免疫在介導(dǎo)DCs疫苗抗腫瘤效應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。近20年以來(lái),人們不斷研究以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗,用于治療各種人類腫瘤。2010年,以DCs為基礎(chǔ)的疫苗(sipuleucel-T)在前列腺癌的治療中取得了顯著的臨床療效,并被美國(guó)食品及藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)作為首個(gè)DC疫苗應(yīng)用于臨床。2012年,在人類卵巢癌的臨床試驗(yàn)中表明,DC疫苗能夠調(diào)動(dòng)卵巢癌患者體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。這些研究均表明DC疫苗在臨床應(yīng)用中有著廣闊的研究前景和較高的研究?jī)r(jià)值,但DC腫瘤疫苗的臨床療效依然低下,這限制了其臨床研究及應(yīng)用。因此,闡明DCs和DC疫苗相關(guān)的抗腫瘤機(jī)制,進(jìn)一步提高其臨床療效,成為腫瘤免疫治療研究領(lǐng)域迫切需要解決的問(wèn)題。我所在的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)Dectin-1信號(hào)活化的DCs(Dectin-1-DCs)的抗腫瘤作用和機(jī)制有較深入和系統(tǒng)的研究。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),Dectin-1-DCs能有效促進(jìn)Th9細(xì)胞的分化,而誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th9細(xì)胞具有強(qiáng)有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)。為了研究Dectin-1-DCs促進(jìn)Th9細(xì)胞分化的機(jī)制,我們通過(guò)基因表達(dá)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Dectin-1信號(hào)激動(dòng)劑Curdlan成熟的DCs(Cur DCs)表達(dá)的IL-33比TNF-α加IL-1β成熟的DCs(BMDCs)明顯增多。然而,Dectin-1-DCs高表達(dá)IL-33的作用和機(jī)制目前尚不清楚。因此,我們進(jìn)行了如下兩部分研究:第一部分:Dectin-1-DCs高表達(dá)的IL-33的作用研究研究方法:1.在BMDCs和Cur DCs體外誘導(dǎo)Th9細(xì)胞生成的過(guò)程中,加入IL33封閉抗體αST2或外源IL-33,檢測(cè)Th9/IL-9的表達(dá)。2.在BMDCs和Cur DCs治療B16-OVA荷瘤OT-II小鼠的過(guò)程中,加入外源IL-33,檢測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的類型。3.在BMDCs和Cur DCs治療B16-OVA荷瘤OT-II小鼠的過(guò)程中,加入外源IL-33,檢測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的增殖能力和表型。4.構(gòu)建MPC-11小鼠多發(fā)性骨髓瘤模型,檢測(cè)IL-33對(duì)Cur DCs抗腫瘤作用的影響。結(jié)果:1.Dectin-1-DCs可誘導(dǎo)Th9細(xì)胞生成,αST2處理可抑制Cur DCs誘導(dǎo)的Th9細(xì)胞分化和IL-9表達(dá),而加入IL-33則顯著促進(jìn)Cur DCs誘導(dǎo)的Th9細(xì)胞分化和IL-9表達(dá)。2.免疫Cur DCs和IL-33的小鼠產(chǎn)生更多的IL-9+CD4+、IFN-γ+CD4+和Gzm B+CD4+T細(xì)胞。3.IL-33能增強(qiáng)Cur DCs免疫的小鼠的CD4+T細(xì)胞的Ki67表達(dá),并能抑制T細(xì)胞PD1的表達(dá),且不影響IL-2的表達(dá)。4.IL-33聯(lián)合Dectin-1-DCs能顯著抑制小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)論:1.IL-33增強(qiáng)Dectin-1-DCs對(duì)體外Th9細(xì)胞的生成作用。2.IL-33增強(qiáng)Dectin-1-DCs對(duì)體內(nèi)Th9細(xì)胞的生成作用。3.IL-33增強(qiáng)Dectin-1-DCs對(duì)體內(nèi)Th9細(xì)胞的增殖能力。4.IL-33增強(qiáng)Dectin-1-DCs的抗腫瘤作用。第二部分:Dectin-1-DCs高表達(dá)IL-33的機(jī)制研究研究方法:1.采用TNFα/IL-1β,Curdlan,GM-CSF,Poly I:C或LPS處理DCs,檢測(cè)DCs中IL-33的m RNA水平。在DCs成熟的過(guò)程中加入Syk特異性抑制劑Piceatannol和Raf-1特異性抑制劑GW5074或其特異性si RNAs,檢測(cè)DCs中IL-33的m RNA水平和蛋白水平。2.在DCs成熟的過(guò)程中加入NF-κB抑制劑Bortizomib(Bor),檢測(cè)DCs中IL-33的m RNA水平和蛋白水平。采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子是否能夠直接與IL-33啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá)。3.分析Cur DCs和BMDCs的基因表達(dá)譜,并驗(yàn)證IRF1,IRF4和IRF7的表達(dá)水平。使用Dectin-1-/-小鼠體外生成DCs,檢測(cè)IRF4和IRF7的表達(dá)水平。4.在DCs成熟的過(guò)程中加入使用Irf4特異性si RNA,檢測(cè)DCs中IL-33的m RNA水平和蛋白水平。Cur DCs誘導(dǎo)Th9的過(guò)程中加入Irf4(si-Irf4)或Il33(si Il33)的si RNAs,檢測(cè)生成的Il9的m RNA水平。5.在DCs成熟的過(guò)程中使用Syk,Raf1和NF-κB的抑制劑和Syk(si-syk)或Raf1(si Raf1)的si RNAs,檢測(cè)DCs中IRF4的m RNA水平和蛋白水平。加入Il33(si Il33)的si RNA檢測(cè)DCs中Il33和Irf4的m RNA水平。結(jié)果:1.Cur DCs促進(jìn)DCs表達(dá)IL-33。抑制或沉默DCs中Syk或Raf-1后,顯著降低Dectin-1-DCs的IL-33表達(dá)。2.抑制NF-κB信號(hào),顯著降低Dectin-1-DCs的IL-33表達(dá)。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子中只有Rel B能輕微的結(jié)合并啟動(dòng)IL-33啟動(dòng)子。3.Cur DCs中IRF4的表達(dá)顯著增加。Dectin-1-/-小鼠體外生成的Cur DCs的IRF4表達(dá)不再升高。4.抑制IRF4的表達(dá),能抑制Curdlan誘導(dǎo)IL-33表達(dá)。沉默Irf4或Il33的Dectin-1-DCs,體外生成Th9更少。5.抑制Syk,Raf1或NF-κB能夠顯著降低Curdlan誘導(dǎo)的DCs表達(dá)IRF4。加入Il33(si Il33)的si RNA不影響Irf4的m RNA水平。結(jié)論:1.Dectin-1通過(guò)Syk和Raf-1刺激IL-33表達(dá)。2.NF-κB間接的參與Dectin-1誘導(dǎo)IL-33表達(dá)。3.Dectin-1刺激DCs表達(dá)IRF4。4.Dectin-1誘導(dǎo)IL-33依賴于IRF4的表達(dá)。5.Dectin-1通過(guò)Syk/Raf1以及NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)IRF4的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.51
【圖文】：

第 1 章 緒論抗原，未成熟 DCs 具有較強(qiáng)的遷移能力，成熟 DCs 則能有效激活初始型 T 胞，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，在誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫程中起到重要作用[1]。通常情況下，人體內(nèi)的 DCs 細(xì)胞數(shù)量很少，只有在抗遞呈細(xì)胞能正常發(fā)揮抗原遞呈作用的時(shí)候，身體才能有效識(shí)別病原，激活獲性免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生正常的免疫反應(yīng)。美國(guó)杜克大學(xué)遺傳和細(xì)胞治療學(xué)中心的究主任埃利-吉爾波瓦說(shuō)過(guò)：“DCs 是激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)激發(fā)抵御癌癥侵襲最效的途徑之一�！� “DCs 作為高度專職化的主要抗原遞呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)針對(duì)相抗原的高效、特異性 T 細(xì)胞免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用。”（如圖 1.1）

我們對(duì) WT 和 Dectin-1-/-小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)Cs 和 CurDCs，同時(shí)分別將這兩種細(xì)胞負(fù)載 OT-II OVA 抗原肽，再分進(jìn)行免疫治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 PBS 對(duì)照相比，BMDCs 則具有一定的應(yīng)，在一定程度上能夠延緩小鼠腫瘤的生長(zhǎng)（圖 1.2A）；而與 BMDCurDCs 具有更強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，免疫 CurDCs 的小鼠的腫瘤減�。▓D 1.2A）。結(jié)果表明，Dectin-1 活化的 DCs 在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)很瘤治療效果。為了進(jìn)一步闡明 Dectin-1 信號(hào)在 DC 疫苗發(fā)揮抗腫瘤效用，給予小鼠免疫 Dectin-1 基因敲除的 CurDCs 則不能抑制小鼠腫瘤不能產(chǎn)生強(qiáng)有力的抗腫瘤治療效果（圖 1.2A）。因此，這個(gè)結(jié)果Cs 具有強(qiáng)有效的抗腫瘤作用，并且該作用依賴于 dectin-1 信號(hào)[10]。

第 1 章 緒論理接種 B16-OVA 腫瘤的 OT-II 鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。1.1.3.4 Dectin-1 與 DCs 表達(dá) IL-33 的關(guān)系在前期研究中，我們?cè)谂囵B(yǎng) DCs 的過(guò)程中，分別加入兩種 Dectin-1 的活化劑 Curdlan 及 Scleroglucan，進(jìn)而活化 DCs 的 Dectin-1 信號(hào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn) CurDCs及 SclDCs 表達(dá)的 IL-33 水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未活化 Dectin-1 信號(hào)的 BMDCs。我們進(jìn)一步通過(guò)來(lái)自于 Dectin-1-/-小鼠的 DCs 進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng) Dectin-1 基因被敲除后，CurDCs 或 SclDCs 均不再表達(dá) IL-33（圖 1.3 A-C）。這些結(jié)果表明，DCs 表達(dá)IL-33 依賴于 Dectin-1 信號(hào)，Dectin-1 信號(hào)促進(jìn) DCs 表達(dá) IL-33[42]。

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1 顧嘉欽;朱s

本文編號(hào)：2754013