【摘要】：第一部分大腸癌大病理切片下的細胞和組織形態(tài)研究目的:通過結(jié)直腸癌腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶大病理切片的細胞和組織形態(tài)學觀察研究,探討大腸癌原發(fā)灶及其不同轉(zhuǎn)移灶組織和細胞形態(tài)改變的特點和細胞分布的規(guī)律;探討其生物學性狀及行為的特點與組織及細胞形態(tài)學改變之間的關(guān)系;通過組織及細胞形態(tài)學的觀察研究,反映腫瘤的生物學性狀和行為現(xiàn)象,進一步揭示結(jié)直腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移可能相關(guān)的機制。方法:本研究共選取了52例III-IV期結(jié)直腸癌患者,其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例、肝轉(zhuǎn)移11例、卵巢轉(zhuǎn)移6例。完整收集患者原發(fā)灶、肝轉(zhuǎn)移灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和卵巢轉(zhuǎn)移灶組織,分別制成大病理切片并進行常規(guī)HE染色,通過EVOS auto智能全自動熒光顯微成像系統(tǒng)對病理大切片進行全層和多層掃描,獲得大病理切片全景和局部放大圖。為了便于對比觀察,原發(fā)灶根據(jù)細胞分布的情況分為腫瘤主體病變區(qū)(低倍鏡下腫瘤性組織和結(jié)構(gòu)最集中的部分)、腫瘤外圍病變區(qū)(低倍鏡下主體病變區(qū)腫瘤性組織和結(jié)構(gòu)連續(xù)性外延的區(qū)域)、腫瘤延展病變區(qū)(低倍鏡下腫瘤性組織和結(jié)構(gòu)連續(xù)性外延終端外,腫瘤的組織和細胞呈散在性、非連續(xù)性的分布區(qū)域)和正常組織區(qū)四個區(qū)域。重點觀察原發(fā)瘤各個區(qū)域、淋巴結(jié)、肝轉(zhuǎn)移灶和卵巢轉(zhuǎn)移灶、癌組織與正常組織交界區(qū)等細胞分布和組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)特點和規(guī)律,測量相關(guān)徑線的數(shù)據(jù)。觀察其細胞形態(tài)及細胞增殖情況的變化。本研究中統(tǒng)計學采用IBM SPSS Statistics 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。對于服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差((?)±s)的形式來描述,組間比較使用獨立樣本t檢驗;對于嚴重偏態(tài)的數(shù)據(jù)則使用中位數(shù)[四分位數(shù)間距](median[IQR])的形式來描述,兩個指標間比較則使用Mann-Whitney檢驗,三個指標間比較使用Kruskal-Wallis H檢驗,若整體差異有統(tǒng)計學意義,進一步的兩兩比較采用Bonferroni檢驗。本文以雙側(cè)P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:(1)原發(fā)灶:絕大部分標本都可以看到腫瘤細胞呈四個區(qū)分布的規(guī)律性;主體病變區(qū)粘膜底層結(jié)構(gòu)明顯破壞,細胞聚集明顯、呈多種形態(tài)并向粘膜表層和深部肌層拓展,甚至完全破壞粘膜表層形成潰瘍區(qū);至腫瘤外圍病變區(qū)交界處粘膜底層的結(jié)構(gòu)逐漸恢復可辨,但粘膜底層細胞存在明顯惡性形態(tài)學改變,其附近組織中有大量連續(xù)分布的腫瘤細胞,常累及部分粘膜表層。越靠近腫瘤的延展區(qū),表面的正常粘膜越厚,病變的細胞逐漸集中于粘膜底層,這一區(qū)域肌層的浸潤也較輕,腫瘤細胞明顯呈散在性分布,細胞或各個小癌灶之間相互不連貫,從整體形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變來看,腫瘤從主體區(qū)向周邊沿著粘膜底層拓展延伸的形態(tài)學特征明顯可見。以粘膜底層的走向為軸線進行測量發(fā)現(xiàn),腫瘤沿粘膜底層病變延伸的長度,遠大于主體病變區(qū)的寬度,P0.05。而就腫瘤細胞在粘膜底層上下兩側(cè)分布的寬度而言,在延展區(qū)明顯呈鼠尾狀,主體病變區(qū)的上下徑明顯大于延展區(qū),P0.05;在延展區(qū)與正常組織的交界處的粘膜底層,易見異型細胞和細胞漸變的形態(tài)學表現(xiàn),其異型細胞數(shù)量明顯多于其它區(qū)域,P0.05。但完全看不到有腫瘤細胞對正常結(jié)構(gòu)產(chǎn)生整體性擠壓、推移的形態(tài)學特征。(2)肝轉(zhuǎn)移灶:大部分肝轉(zhuǎn)移灶與正常組織的交界區(qū)與原發(fā)灶明顯不同,存在環(huán)繞轉(zhuǎn)移灶主體的纖維組織結(jié)構(gòu),形成類似包膜樣的結(jié)構(gòu),纖維組織結(jié)構(gòu)鄰近肝組織可見到散在分布的腫瘤細胞或異型細胞;主灶細胞呈巢狀分布,無分布的規(guī)律性和方向性,形態(tài)上接近于原發(fā)灶腫瘤,細胞大小和形態(tài)的一致性好于原發(fā)灶主體病變區(qū),僅從細胞形態(tài)學的情況無法區(qū)分其與原發(fā)灶細胞及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶細胞的差別。(3)卵巢轉(zhuǎn)移灶:本組卵巢轉(zhuǎn)移灶都分布于卵巢實質(zhì)內(nèi),腫瘤細胞在卵巢實質(zhì)內(nèi)呈巢狀分布,形態(tài)上類似于腫瘤原發(fā)灶的主體區(qū),癌巢周圍沒有纖維組織環(huán)繞,常見散在性分布的異型細胞,且癌巢周圍的邊界不清晰,卵巢病變區(qū)的組織形態(tài)與肝及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶相比明顯混亂,細胞形態(tài)呈多樣性,常見小圓細胞,難以鑒別細胞的來源和形態(tài)特征,與原發(fā)灶及其他部位轉(zhuǎn)移灶存在明顯的形態(tài)學差異。(4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶:腫瘤細胞主要也呈巢狀分布,形態(tài)類似于原發(fā)灶主體區(qū),癌巢周圍無纖維組織環(huán)繞,可見散在分布的腫瘤細胞或異型細胞,與正常的淋巴細胞及異型細胞間雜分布,腫瘤細胞的形態(tài)與原發(fā)灶及肝轉(zhuǎn)移灶接近,無法靠形態(tài)學區(qū)分,細胞大小和形態(tài)的一致性較好。結(jié)論:本組以上大腸癌不同病灶大病理切片形態(tài)學觀察研究的結(jié)果提示:(1)大腸癌不同病灶的組織和細胞形態(tài)學改變有一定的規(guī)律,且可反映不同病灶腫瘤細胞各自的某些生物學性狀和行為特點;(2)腫瘤細胞在大腸癌原發(fā)灶的不同區(qū)域和不同的病灶中存在行為學的異質(zhì)性,這種異質(zhì)性的產(chǎn)生可能與腫瘤細胞的生物學性狀和多向分化傳代有關(guān);(3)腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及生長發(fā)展方式可能與腫瘤細胞的生物學性狀有關(guān),而細胞增殖可能是大腸癌各轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶主體病變區(qū)的主要生長方式;(4)卵巢轉(zhuǎn)移灶形態(tài)學的明顯差異提示,大腸癌的卵巢轉(zhuǎn)移可能不僅僅是細胞事件,可能與卵巢自身特殊的生物結(jié)構(gòu)環(huán)境和腫瘤的全身環(huán)境有關(guān)。第二部分干細胞誘導實驗及原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶三種分子蛋白表達的檢測目的:在大病理切片組織形態(tài)學研究的基礎(chǔ)上,通過對原發(fā)灶不同區(qū)域及不同轉(zhuǎn)移灶蛋白表達情況的對比檢測和臍帶間充質(zhì)干細胞誘導培養(yǎng)的觀察,進一步綜合了解和揭示腫瘤原發(fā)灶不同區(qū)域及相關(guān)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞生物學性狀差異的情況,初步判斷多向分化潛能細胞在特定生物環(huán)境下被誘導生長的可能性,進一步說明腫瘤不同區(qū)域組織形態(tài)學特點的差異可能與腫瘤細胞的生物學性狀差異有關(guān)。方法:(1)大病理切片特殊染色分析:在前述大病理切片基礎(chǔ)上,分別對原發(fā)灶及不同部位的轉(zhuǎn)移灶組織進行P53、VEGF和β-catenin的免疫組化染色,通過EVOS auto智能全自動熒光顯微成像系統(tǒng)對切片進行全層和多層掃描,獲得切片全景和局部放大圖,由兩位資深(副高以上)病理科醫(yī)生分別讀片,原發(fā)灶按前述分區(qū),分別觀察記錄三種檢測指標在不同病灶和區(qū)域的表達情況和數(shù)據(jù),意見不一致時二人會診討論決定。(2)臍帶間充質(zhì)干細胞誘導培養(yǎng)觀察:把經(jīng)過質(zhì)檢的同一來源批次和數(shù)量的臍帶間充質(zhì)干細胞分為對照組和實驗組;對照組用標準培養(yǎng)液加健康血清,實驗組用標準培養(yǎng)液加晚期結(jié)直腸癌病人去細胞癌性腹水在同一條件下進行培養(yǎng);分別于培養(yǎng)后24和48小時對細胞生長情況和細胞形態(tài)學情況進行觀察,計數(shù)和記錄。本研究中統(tǒng)計學采用IBM SPSS Statistics 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。對于服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差((?)±s)的形式來描述,組間比較使用獨立樣本t檢驗;對于嚴重偏態(tài)的數(shù)據(jù)則使用中位數(shù)[四分位數(shù)間距](median[IQR])的形式來描述,兩個指標間比較則使用Mann-Whitney檢驗,三個指標間比較使用Kruskal-Wallis H檢驗,若整體差異有統(tǒng)計學意義,進一步的兩兩比較采用Bonferroni檢驗。本文以雙側(cè)P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1、原發(fā)灶不同區(qū)域及不同轉(zhuǎn)移灶蛋白表達情況:(1)原發(fā)灶:P53在原發(fā)灶的各區(qū)均有表達,但以腫瘤主體病變區(qū)最為明顯;VEGF在腫瘤的各個區(qū)域也均有表達,但腫瘤的外圍區(qū)及延展區(qū)表達明顯高于主體病變區(qū);而β-catenin在腫瘤的外圍區(qū)表達最為明顯,主體病變區(qū)、延展區(qū)及正常組織區(qū)也有表達;結(jié)果提示,原發(fā)灶腫瘤主體區(qū)、腫瘤外圍區(qū)、延展區(qū)及正常組織區(qū)P53、VEGF和β-catenin的表達情況,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.001)。兩兩比較亦顯示,任意兩個區(qū)的P53、VEGF表達情況,差異亦有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)肝轉(zhuǎn)移灶:三種蛋白表達物的表達與其他病灶也存在差異,VEGF主要在肝轉(zhuǎn)移灶的周邊區(qū)表達率較高(8/11,73%),但P53則呈整體表達。(3)卵巢轉(zhuǎn)移灶:P53、VEGF和β-catenin蛋白在卵巢轉(zhuǎn)移灶均呈較高表達表達但其表達強度仍存在不同的差異。(4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶:三種蛋白表達物在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達與卵巢轉(zhuǎn)移灶的表達情況較接近,但與原發(fā)灶不同區(qū)域的表達對比存在明顯差異。2、臍帶間充質(zhì)干細胞誘導培養(yǎng)觀察結(jié)果:觀察結(jié)果提示,誘導培養(yǎng)前后間充質(zhì)干細胞的形態(tài)明顯發(fā)生變化,誘導培養(yǎng)前細胞的形態(tài)均一,細胞扁平,形態(tài)類似成纖維細胞,分布均勻,排列有序。誘導培養(yǎng)24和48h后,與對照組細胞相比,MSCs的細胞形態(tài)均發(fā)生顯著變化,細胞變圓變短,細胞核增大。同時,與對照組相比細胞的增殖速率顯著提高,增殖曲線上移,并隨著腹水比例的增加而顯著上升。結(jié)論:根據(jù)本組大腸癌原發(fā)灶及不同轉(zhuǎn)移灶免疫組化檢測和臍帶間充質(zhì)干細胞誘導培養(yǎng)觀察所見,結(jié)合前述常規(guī)大病理切片研究的結(jié)果,有以下幾點值得總結(jié):(1)大腸癌原發(fā)灶不同區(qū)域的細胞確實存在生物表達的差異,說明其生物學性狀存在差異,也可以初步說明其行為學及相應(yīng)組織形態(tài)差異的可能原因。(2)大腸癌原發(fā)灶不同區(qū)域以及各轉(zhuǎn)移灶之間的生物表達存在差異,提示不同的轉(zhuǎn)移灶細胞可能來源于原發(fā)灶的不同區(qū)域或細胞。(3)大腸癌原發(fā)灶和不同轉(zhuǎn)移灶細胞生物學性狀及行為的異質(zhì)性,可能與大腸癌原發(fā)灶中細胞的多向分化有關(guān)。(4)臍帶間充質(zhì)干細胞誘導培養(yǎng)的結(jié)果提示,腫瘤性的生物環(huán)境,極有可能對具有分化潛能的細胞產(chǎn)生生物誘導作用,是否對腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤機制具有生物學意義,應(yīng)該進一步深入研究。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34
【圖文】：

2730個細胞，對30個細胞中出現(xiàn)的正常細胞進行細胞計數(shù)。對比其之間的差異性；(圖1-1C)（3）觀察發(fā)灶與各轉(zhuǎn)移灶的細胞和組織形態(tài)學特點，對比原發(fā)灶與各轉(zhuǎn)移灶之間細胞和組織形態(tài)學的差異。圖1-1 原發(fā)灶大病理切片分區(qū)示意圖及細胞計數(shù)示意圖Figure 1-1 A: Pathological section of primary lesion in a typical large pathological section; B: Schematicdiagram of pathological section of primary lesion; C: Cell counts schematic

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本文編號：2753640