【摘要】：研究背景：在世界范圍內(nèi),惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率仍然居高不下,其診斷和治療依舊是目前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中亟待解決的難題。其中,乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重影響患者身心健康甚至危及生命。腫瘤患者經(jīng)常并發(fā)各種因素引起的貧血,貧血可使病人感到疲勞、乏力、頭暈、心悸、惡心甚至抑郁等不適癥狀,直接影響患者的精神狀況和生活質(zhì)量,同時干擾了癌癥患者的臨床治療。癌癥相關(guān)貧血的病因和治療尚無定論,腫瘤和紅細(xì)胞生成系統(tǒng)之間的相互作用及相互影響是近幾年腫瘤研究的熱點之一。研究惡性腫瘤相關(guān)貧血及其機(jī)制可為臨床患者的相關(guān)治療提供重要的理論基礎(chǔ)。紅細(xì)胞發(fā)育經(jīng)歷了從造血干細(xì)胞到紅系爆式集落形成單位、紅系集落形成單位、原紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞,最后發(fā)育為成熟紅細(xì)胞的過程。在生理狀態(tài)下,骨髓為主要的造血器官；而在急性貧血,炎癥性貧血(AI)等病理狀態(tài)下,機(jī)體可啟動髓外造血機(jī)制,通過增加Epo的分泌,刺激脾或肝進(jìn)行應(yīng)激性造血,以增加循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量,緩解貧血狀況。近年研究表明,脾內(nèi)獨特的微環(huán)境能夠維持應(yīng)激性紅細(xì)胞生成,巨噬細(xì)胞在病理性紅細(xì)胞生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為了更深入的了解癌癥,貧血和紅細(xì)胞生成系統(tǒng)之間的關(guān)系,我們應(yīng)用小鼠乳腺癌模型檢測了脾臟在荷瘤鼠中的紅細(xì)胞生成作用及其機(jī)制。研究目的：1、在生理條件下,紅細(xì)胞的生成過程受復(fù)雜的反饋機(jī)制調(diào)節(jié),以使循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)紅細(xì)胞(RBCs)數(shù)量維持在機(jī)體適宜的水平。在慢性感染,惡性腫瘤,慢性腎臟疾病等慢性炎癥條件下可發(fā)生炎癥性貧血,是臨床上最常見的一種貧血形式。體內(nèi)鐵含量以及蛋白質(zhì)等的營養(yǎng)缺乏,紅細(xì)胞的壽命縮短,促紅細(xì)胞生成素(Epo)的合成減少,以及骨髓造血功能受損等都可影響體內(nèi)紅細(xì)胞生成。因此,腫瘤負(fù)荷鼠的貧血狀況以及分析引起荷瘤鼠貧血的原因,是本文的研究目的之一。2、人體在出生后,紅系祖細(xì)胞主要在骨髓內(nèi)分化、發(fā)育、成熟。機(jī)體功能紊亂時,脾臟開始進(jìn)行應(yīng)激性的紅細(xì)胞生成。因此,乳腺腫瘤對骨髓紅細(xì)胞生成的影響以及荷瘤鼠中脾的應(yīng)激紅細(xì)胞生成作用是本文的另一個研究目的。3、脾的應(yīng)激性紅細(xì)胞生成作用需要巨噬細(xì)胞分泌的骨形態(tài)生成蛋白4(BMP4)的參與,其可刺激脾內(nèi)紅系祖細(xì)胞增殖并分化成紅系爆式集落形成單位(BFU-E),且快速發(fā)育為成熟的紅細(xì)胞。因此,腫瘤負(fù)荷鼠中脾紅細(xì)胞生成的分子機(jī)制是本文的又一研究目的。實驗方法：第一部分：乳腺腫瘤負(fù)荷小鼠貧血狀況及貧血原因分析1、小鼠乳腺癌模型的建立及貧血狀況的測定1.1實驗小鼠隨機(jī)分組,建立小鼠乳腺癌模型。1.2小鼠接種腫瘤細(xì)胞后第4周,取血,用血細(xì)胞自動分析儀檢測實驗小鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積以及網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目。2、乳腺腫瘤負(fù)荷小鼠血清內(nèi)炎癥因子的變化乳腺腫瘤細(xì)胞在小鼠乳腺原位接種后,不同時間點取小鼠血清,采用Elisa的方法檢測炎性因子IL-6, IFN-γ, TNF-α的相關(guān)變化。3、荷瘤鼠體內(nèi)血清鐵含量的測定用血清鐵及總鐵結(jié)合力檢測試劑盒測定荷瘤鼠體內(nèi)血清鐵及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的變化。4、荷瘤鼠體內(nèi)紅細(xì)胞壽命的檢測用生物素標(biāo)記紅細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測荷瘤鼠體內(nèi)紅細(xì)胞壽命的變化。5、荷瘤鼠血清內(nèi)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)含量的測定流式Cytometric Bead Array (CBA)法檢測接種腫瘤細(xì)胞后不同時間點小鼠血清內(nèi)G-CSF含量的變化。同時檢測培養(yǎng)4T1細(xì)胞的上清液中G-CSF的含量。第二部分：乳腺腫瘤對小鼠骨髓內(nèi)紅細(xì)胞生成情況的影響1、腫瘤負(fù)荷鼠股骨外觀變化1.1脫頸處死小鼠,剝離其股骨,觀察其外觀的改變。1.2用充滿生理鹽水的注射器將小鼠股骨骨髓沖出,制備成單細(xì)胞懸液,在顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板檢測荷瘤鼠骨髓內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的變化。2、乳腺腫瘤對骨髓內(nèi)紅系祖細(xì)胞的影響用相應(yīng)的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基對小鼠骨髓內(nèi)BFU-E,CFU-E分別進(jìn)行原代培養(yǎng),一定時間后在顯微鏡下觀察各自形成的集落數(shù)目,并計數(shù)。3、乳腺腫瘤對骨髓內(nèi)紅系細(xì)胞分化的的影響用CD71和Terl19抗體與骨髓細(xì)胞共孵育,流式細(xì)胞儀檢測乳腺腫瘤對骨髓內(nèi)紅系細(xì)胞分化的影響。4、G-CSF對小鼠骨髓內(nèi)紅細(xì)胞生成的影響4.1給正常小鼠注射G-CSF,觀察其對小鼠股骨外觀及骨髓內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的影響。4.2制備小鼠骨髓單細(xì)胞懸液,對骨髓內(nèi)BFU-E, CFU-E進(jìn)行原代培養(yǎng),觀察G-CSF對骨髓內(nèi)紅系祖細(xì)胞的影響。4.3制備小鼠骨髓單細(xì)胞懸液,用CD71和Terl19抗體與骨髓細(xì)胞共孵育,流式細(xì)胞儀檢測G-CSF對骨髓內(nèi)紅系細(xì)胞分化的影響。第三部分：乳腺腫瘤負(fù)荷小鼠脾臟應(yīng)激性紅細(xì)胞生成作用1、乳腺腫瘤對小鼠脾形態(tài)的影響1.1脫頸處死小鼠,取小鼠脾臟,觀察其外觀并稱量脾的重量。1.2將小鼠脾臟研磨成單細(xì)胞,并制備成單細(xì)胞懸液,在顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板檢測荷瘤鼠脾內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的變化。2、乳腺腫瘤對脾內(nèi)紅系祖細(xì)胞的影響取小鼠脾臟,研磨成單細(xì)胞后,用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,相應(yīng)的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基分別對小鼠脾內(nèi)BFU-E, CFU-E進(jìn)行原代培養(yǎng),一定時間后在顯微鏡下觀察其形成的集落數(shù)目,并計數(shù)。3、乳腺腫瘤對脾內(nèi)紅系細(xì)胞分化的影響用CD71和Terl19抗體與小鼠脾細(xì)胞共孵育,流式細(xì)胞儀檢測乳腺腫瘤對脾內(nèi)紅系細(xì)胞分化的的影響。4、G-CSF對小鼠脾臟紅細(xì)胞生成作用的影響4.1通過給正常小鼠注射G-CSF,觀察G-CSF對小鼠脾形態(tài)及脾內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的影響。4.2取小鼠脾臟,制備脾的單細(xì)胞懸液,對脾內(nèi)BFU-E, CFU-E進(jìn)行原代培養(yǎng),觀察G-CSF對脾內(nèi)紅系祖細(xì)胞的影響。4.3將小鼠脾臟研磨,制備成單細(xì)胞懸液后,用CD71和Terl 19抗體與脾細(xì)胞共孵育,檢測G-CSF對脾內(nèi)紅系細(xì)胞分化的影響。第四部分：脾切除對腫瘤誘導(dǎo)的應(yīng)激性紅細(xì)胞生成作用的影響1、脾切除對荷瘤鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)血細(xì)胞的影響1.1對正常小鼠進(jìn)行脾的切除手術(shù),兩周后給小鼠接種腫瘤細(xì)胞。1.2在小鼠接種腫瘤細(xì)胞后的第1,2,3,4周時,取血,用血細(xì)胞自動分析儀檢測小鼠外周血中各類血細(xì)胞的相關(guān)情況。2、脾切除后荷瘤鼠血清內(nèi)主要的炎性因子的變化采用Elisa的方法檢測脾切除的荷瘤鼠血清內(nèi)主要的炎性因子IL-6和IFN-Y的相關(guān)變化。3、脾切除的腫瘤負(fù)荷鼠體內(nèi)血清鐵含量的測定用血清鐵及總鐵結(jié)合力檢測試劑盒測定脾切除后的乳腺腫瘤負(fù)荷鼠體內(nèi)血清鐵及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的變化。4、脾切除的荷瘤鼠血清內(nèi)G-CSF含量的測定同樣的,用流式CBA的方法檢測脾切除的小鼠在接種腫瘤細(xì)胞后第1,2,3,4周時血清內(nèi)G-CSF含量的變化。5、G-CSF對脾切除的小鼠循環(huán)系統(tǒng)血細(xì)胞的影響脾切除后給小鼠單獨注射G-CSF,取血測血常規(guī),觀察G-CSF對脾切除的小鼠外周血中血細(xì)胞的影響。第五部分：巨噬細(xì)胞在腫瘤引起的脾臟應(yīng)激性紅細(xì)胞生成中的作用1、刪除體內(nèi)的巨噬細(xì)胞對荷瘤鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)紅細(xì)胞的影響1.1在小鼠接種腫瘤細(xì)胞后的第7天和第18天時給小鼠尾靜脈注射脂質(zhì)體-氯曲膦酸以刪除體內(nèi)的巨噬細(xì)胞。1.2小鼠接種腫瘤細(xì)胞后的第4周,取血,用血細(xì)胞自動分析儀檢測刪除了巨噬細(xì)胞的荷瘤鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量,血紅蛋白含量以及紅細(xì)胞壓積的改變。2、脂質(zhì)體-氯曲膦酸對荷瘤鼠脾臟應(yīng)激性紅細(xì)胞生成作用的影響2.1對注射脂質(zhì)體-氯曲膦酸的荷瘤鼠和注射脂質(zhì)體的荷瘤鼠脾內(nèi)BFU-E, CFU-E進(jìn)行原代培養(yǎng),觀察脂質(zhì)體-氯曲膦酸對腫瘤負(fù)荷鼠脾內(nèi)紅系祖細(xì)胞的影響。2.2取各實驗小鼠脾臟,研磨,制備單細(xì)胞懸液,用CD71和Terl 19抗體與脾細(xì)胞共孵育,流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞刪除對荷瘤鼠脾內(nèi)紅系細(xì)胞分化的影響。3、巨噬細(xì)胞參與腫瘤應(yīng)激性脾紅細(xì)胞生成的分子機(jī)制3.1用Elisa方法檢測實驗小鼠血清內(nèi)促紅細(xì)胞生成素(Epo)的含量。3.2 RT-PCR和免疫組化法分別檢測各組小鼠脾內(nèi)骨形態(tài)生成蛋白(BMP4)的]mRNA水平及蛋白含量。3.3使用共聚焦顯微鏡觀察腫瘤負(fù)荷鼠脾內(nèi)巨噬細(xì)胞和BMP4的共定位情況。3.4用脂質(zhì)體-氯曲膦酸刪除荷瘤小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞,分別用RT-PCR、免疫組化和共聚焦顯微鏡觀察其對荷瘤鼠脾內(nèi)BMP4 mRNA水平及蛋白表達(dá)的影響。4、脾應(yīng)激性紅細(xì)胞生成對腫瘤生長的影響在小鼠接種腫瘤細(xì)胞后的第6天開始,每隔兩天測量一次腫瘤體積直至第28天,脫頸處死小鼠,剝離腫瘤,稱重,通過瘤體積和瘤重觀察脾切除及脂質(zhì)體-氯曲膦酸處理對腫瘤生長的影響。結(jié)果：第一部分：乳腺癌荷瘤小鼠表現(xiàn)出貧血表型,其血清內(nèi)G-CSF含量顯著升高1、小鼠乳腺癌模型的建立及貧血狀況的測定用血細(xì)胞自動分析儀檢測發(fā)現(xiàn),在小鼠乳腺癌移植模型4T1乳腺腫瘤負(fù)荷鼠中,外周血紅細(xì)胞數(shù)量,血紅蛋白含量以及紅細(xì)胞壓積與正常小鼠相比均明顯降低,而網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目反饋性地增高。2、乳腺癌荷瘤小鼠血清內(nèi)炎性因子的變化用Elisa的方法檢測發(fā)現(xiàn),隨著時間的延長,荷瘤鼠血清內(nèi)主要的炎性因子IL-6和IFN-y與正常小鼠一直沒有明顯區(qū)別,IL-6僅在癌癥后期稍增高,TNF-a在小鼠血清內(nèi)未檢測到。3、荷瘤鼠體內(nèi)血清鐵含量的測定用血清鐵及總鐵結(jié)合力檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)荷瘤鼠體內(nèi)血清鐵及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度與正常小鼠相比基本上沒有明顯區(qū)別。4、荷瘤鼠體內(nèi)紅細(xì)胞壽命的檢測通過用生物素標(biāo)記紅細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測,流式圖及統(tǒng)計結(jié)果顯示腫瘤負(fù)荷鼠與正常小鼠體內(nèi)的紅細(xì)胞壽命幾近相同。5、荷瘤鼠血清內(nèi)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)含量的測定用流式Cytometric Bead Array (CBA)的方法檢測荷瘤鼠血清內(nèi)G-CSF含量,結(jié)果顯示在小鼠接種腫瘤細(xì)胞后第1周,小鼠血清內(nèi)G-CSF含量即已明顯升高,并隨著時間的延長,其含量穩(wěn)定在較高的水平。培養(yǎng)4T1細(xì)胞的上清液中也含有較高的G-CSF。第二部分：乳腺腫瘤可通過升高體內(nèi)的G-CSF破壞骨髓內(nèi)紅細(xì)胞生成1、腫瘤負(fù)荷鼠股骨外觀變化腫瘤負(fù)荷鼠的股骨顏色較正常小鼠明顯變白,同時骨髓細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示給小鼠接種腫瘤細(xì)胞后,隨著時間的延長,荷瘤鼠骨髓內(nèi)細(xì)胞數(shù)逐漸減少。2、乳腺腫瘤對骨髓內(nèi)紅系祖細(xì)胞的影響用相應(yīng)的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)髓內(nèi)紅系祖細(xì)胞,計數(shù)結(jié)果顯示隨著腫瘤的不斷增長,骨髓內(nèi)BFU-E和CFU-E的集落數(shù)目逐漸減少。3、乳腺腫瘤對骨髓內(nèi)紅系細(xì)胞分化的影響用帶有熒光標(biāo)記的CD71和Terl 19抗體與骨髓細(xì)胞共孵育,從流式圖中我們發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤負(fù)荷鼠的骨髓內(nèi),CD71陽性和Terl19陽性細(xì)胞比率隨著時間的延長而逐漸減少。同時,統(tǒng)計結(jié)果也顯示,荷瘤鼠骨髓內(nèi)CD71單陽性和Terl19單陽性的細(xì)胞數(shù)隨著時間的延長也逐漸減少。4、G-CSF對小鼠骨髓內(nèi)紅細(xì)胞生成的影響G-CSF可動員骨髓造血干細(xì)胞由骨髓釋放入外周血,作為陽性對照,我們給正常小鼠皮下注射外源性G-CSF,實驗結(jié)果顯示注射G-CSF的小鼠表現(xiàn)出相同的骨髓抑制,具體表現(xiàn)為股骨顏色較正常小鼠明顯變白,骨髓內(nèi)總細(xì)胞數(shù)明顯減少,且紅系祖細(xì)胞集落形成單位BFU-E, CFU-E數(shù)目顯著降低,CD71陽性和Terl 19陽性細(xì)胞數(shù)也明顯減少。第三部分：乳腺腫瘤分泌的G-CSF可刺激脾進(jìn)行應(yīng)激性紅細(xì)胞生成1、乳腺腫瘤對小鼠脾形態(tài)的影響在給小鼠接種腫瘤細(xì)胞后不同時間點,脫頸處死小鼠,取脾,我們發(fā)現(xiàn)在小鼠接種腫瘤細(xì)胞后第一周,脾臟較正常小鼠便明顯增大,并且隨著時間的延長,荷瘤鼠的脾臟逐步增大。脾重和脾細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示,隨著腫瘤的不斷增長,小鼠脾重逐漸增加,脾內(nèi)細(xì)胞數(shù)也逐漸增多。2、乳腺腫瘤對脾內(nèi)紅系祖細(xì)胞的影響用相應(yīng)的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)脾內(nèi)紅系祖細(xì)胞,一定時間后計數(shù),結(jié)果顯示在小鼠接種腫瘤細(xì)胞后第二周,脾內(nèi)BFU-E和CFU-E的集落數(shù)較正常小鼠明顯增多,且隨著時間的延長,其數(shù)量逐漸增多。3、乳腺腫瘤對脾內(nèi)紅系細(xì)胞分化的影響用CD71和Terl 19抗體聯(lián)合處理脾細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤負(fù)荷鼠的脾內(nèi)CD71陽性和Terl 19陽性的細(xì)胞比率隨著腫瘤的不斷增長而逐漸增多。統(tǒng)計結(jié)果也顯示,腫瘤負(fù)荷鼠的脾內(nèi)CD71單陽性和Terl 19單陽性的細(xì)胞數(shù)隨著時間的延長也逐漸增多。4、G-CSF對小鼠脾臟紅細(xì)胞生成作用的影響作為陽性對照,我們給正常小鼠皮下注射外源性G-CSF,結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射G-CSF的小鼠脾臟較正常小鼠明顯增大,脾重也明顯增加。同時,脾內(nèi)紅系祖細(xì)胞集落形成單位BFU-E, CFU-E數(shù)目顯著增多,且脾內(nèi)CD71陽性和Terl19陽性細(xì)胞數(shù)也明顯增多。第四部分：脾在乳腺腫瘤引起的應(yīng)激性紅細(xì)胞生成中發(fā)揮著重要的作用1、脾切除對荷瘤鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)血細(xì)胞的影響給正常小鼠進(jìn)行脾的切除手術(shù),兩周后給小鼠接種腫瘤細(xì)胞,分別在腫瘤細(xì)胞接種后1周,2周,3周,4周時取血測血常規(guī)。結(jié)果顯示,在接種腫瘤細(xì)胞后的第二周,脾切除的乳腺腫瘤負(fù)荷鼠就表現(xiàn)出嚴(yán)重的貧血,紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積以及網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)均明顯減少。而假手術(shù)的腫瘤負(fù)荷鼠在第3周時僅表現(xiàn)出輕微的貧血,且貧血程度較脾切除的腫瘤負(fù)荷鼠弱。荷瘤鼠體內(nèi)白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞數(shù)目明顯升高,脾切除的荷瘤小鼠較假手術(shù)的荷瘤小鼠升高更明顯。脾切除而未接種腫瘤細(xì)胞的小鼠和假手術(shù)的正常小鼠相比血常規(guī)沒有明顯差異。2、脾切除后荷瘤鼠血清內(nèi)主要的炎性因子的變化用Elisa法檢測發(fā)現(xiàn)脾切除的腫瘤負(fù)荷鼠與假手術(shù)的腫瘤負(fù)荷鼠相比,炎性因子IL-6, IFN-r基本上沒有明顯區(qū)別。3、脾切除的腫瘤負(fù)荷鼠體內(nèi)血清鐵含量的測定用血清鐵及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)脾切除的腫瘤負(fù)荷鼠與假手術(shù)的腫瘤負(fù)荷鼠相比血清鐵及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度均無顯著差異。4、脾切除的荷瘤鼠血清內(nèi)G-CSF含量的測定流式CBA法檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤負(fù)荷鼠的脾切除組和假手術(shù)組血清G-CSF含量均明顯升高。5. G-CSF對脾切除的小鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)血細(xì)胞的影響脾切除后給小鼠皮下注射外源性的G-CSF,取血測血常規(guī),結(jié)果顯示,脾切除的G-CSF組與假手術(shù)的G-CSF組相比,小鼠表現(xiàn)出更為明顯的貧血。其紅細(xì)胞數(shù)量,血紅蛋白含量及紅細(xì)胞壓積較正常小鼠顯著降低。第五部分：巨噬細(xì)胞參與腫瘤引起的脾內(nèi)病理性紅細(xì)胞生成1、刪除體內(nèi)的巨噬細(xì)胞對荷瘤鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)紅細(xì)胞的影響用脂質(zhì)體-氯曲膦酸刪除小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞,取血測血常規(guī),結(jié)果顯示注射了脂質(zhì)體-氯曲膦酸的腫瘤負(fù)荷鼠,外周血紅細(xì)胞數(shù)目、血紅蛋白含量以及紅細(xì)胞壓積均明顯低于對照組即注射脂質(zhì)體的腫瘤負(fù)荷鼠。2、脂質(zhì)體-氯曲膦酸對荷瘤鼠脾臟應(yīng)激性紅細(xì)胞生成作用的影響我們觀察到注射了脂質(zhì)體-氯曲膦酸的腫瘤負(fù)荷鼠脾臟形態(tài)較對照組荷瘤鼠明顯減小。用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)脾內(nèi)紅系祖細(xì)胞,結(jié)果顯示脂質(zhì)體-氯曲膦酸可影響腫瘤負(fù)荷鼠脾內(nèi)BFU-E和CFU-E的數(shù)量。用CD71抗體和Terl 19抗體聯(lián)合處理脾細(xì)胞,從流式圖及統(tǒng)計結(jié)果可知刪除了巨噬細(xì)胞的腫瘤負(fù)荷鼠脾內(nèi)CD71陽性和Ter119陽性細(xì)胞較未刪除巨噬細(xì)胞的腫瘤負(fù)荷小鼠明顯減少。3、巨噬細(xì)胞參與腫瘤應(yīng)激引起的脾內(nèi)紅細(xì)胞生成的分子機(jī)制3.1用Elisa法檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤負(fù)荷鼠血清中Epo水平較正常小鼠明顯升高。3.2實時PCR結(jié)果顯示,在接種腫瘤細(xì)胞后的第2周,荷瘤鼠脾內(nèi)BMP4mRNA的表達(dá)即明顯升高。同時,免疫組化結(jié)果也顯示隨著腫瘤的生長,荷瘤鼠脾內(nèi)BMP4的蛋白表達(dá)也逐步升高。3.3用F480標(biāo)記巨噬細(xì)胞,共聚焦觀察巨噬細(xì)胞和BMP4的共定位情況,結(jié)果顯示腫瘤負(fù)荷鼠脾內(nèi)大量巨噬細(xì)胞可分泌BMP4。3.4用脂質(zhì)體氯曲膦酸刪除體內(nèi)巨噬細(xì)胞,實時PCR及免疫組化結(jié)果顯示腫瘤負(fù)荷鼠脾內(nèi)BMP4 mRNA水平及蛋白表達(dá)與對照組荷瘤小鼠相比均明顯降低,另外,共聚焦結(jié)果也顯示刪除體內(nèi)巨噬細(xì)胞后,腫瘤負(fù)荷鼠的脾內(nèi)巨噬細(xì)胞和BMP4的表達(dá)均明顯減少。4、脾應(yīng)激性紅細(xì)胞生成對腫瘤生長的影響通過測量腫瘤體積及瘤重,結(jié)果顯示脾切除和巨噬細(xì)胞的刪除可抑制腫瘤的生長。結(jié)論：1、小鼠乳腺癌細(xì)胞可分泌G-CSF, G-CSF可誘導(dǎo)骨髓紅細(xì)胞生成抑制,導(dǎo)致乳腺癌荷瘤小鼠貧血。2、在乳腺腫瘤應(yīng)激狀態(tài)下,小鼠脾臟紅細(xì)胞生成功能被激發(fā),脾切除后,小鼠外周血紅細(xì)胞減少明顯,貧血癥狀加重。3、荷瘤鼠的貧血狀況可促使體內(nèi)Epo水平升高,Epo可刺激髓外造血器官脾內(nèi)的巨噬細(xì)胞分泌BMP4, BMP4又可促進(jìn)脾內(nèi)紅系造血祖細(xì)胞的增殖并逐步分化為成熟的紅細(xì)胞,從而緩解貧血狀況。4、脾切除或巨噬細(xì)胞刪除可誘導(dǎo)外周血紅細(xì)胞減少,兩者均能抑制乳腺腫瘤的生長,提示病理性的脾內(nèi)紅細(xì)胞生成有助于腫瘤生長。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9;R-332

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本文編號：2752435