【摘要】：研究背景:肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)指肝細胞發(fā)生了癌變而形成的惡性腫瘤,是肝癌的主要組成部分,因此簡稱為肝癌。肝癌發(fā)病隱匿、惡性程度高,且不易早期發(fā)現(xiàn),導致其治療效果欠佳。目前藥物治療依然是肝癌除手術(shù)之外的主要治療途徑。然而目前的化療藥物并不能對所有肝癌患者都有較好的療效,因此尋找新的抗肝癌藥物十分重要。青蒿素是從黃花蒿葉中提取出來的一種有效的抗瘧疾成分。二氫青蒿素(Dyhidroartemisinin,DHA)是青蒿素的衍生物,不僅有較強的抗瘧疾作用,還有明顯的抗腫瘤活性。研究表明,DHA可通過調(diào)節(jié)細胞miRNA水平,調(diào)控細胞凋亡和自噬水平,介導細胞DNA損傷與修復而發(fā)揮抗癌活性。然而,其抗癌的具體分子機制仍未明確。端粒保護蛋白TPP1是維持端粒結(jié)構(gòu)的完整性和基因組穩(wěn)定性方面的“中堅力量”,抑制TPP1表達可以通過誘導DNA損傷反應(yīng)(DNA Damage Response,DDR)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究表明,端粒功能障礙能誘導人成纖維細胞系中的自噬流,經(jīng)紫外線照射的黑色素細胞的DDR可以調(diào)控自噬。研究發(fā)現(xiàn),DHA能調(diào)控多種細胞自噬。因此,DHA的作用機制可能與自噬及DNA損傷有密切關(guān)系。那么,DHA是否可以通過調(diào)控肝癌細胞HepG2.2.15的DNA損傷與自噬而影響細胞的生物學行為呢?基于上述科學設(shè)想,本研究擬通過探討DHA對肝癌細胞HepG2.2.15自噬和DNA損傷的影響,以及調(diào)控TPP1的表達對Hep G2.2.15細胞自噬和DNA損傷的影響,初步闡述DHA對HepG2.2.15細胞生物學行為的影響及其分子機制,為HCC的治療提供新思路。研究目的:1.探討二氫青蒿素對肝癌細胞HepG2.2.15生物學行為的影響。2.探討二氫青蒿素作用于HepG2.2.15細胞的潛在分子機制。研究方法:1.二氫青蒿素作用于HepG2.2.15細胞后,再用CCK8、結(jié)晶紫實驗、Transwell實驗、細胞劃痕實驗、平板克隆形成實驗及軟瓊脂糖克隆形成實驗分別檢測細胞的增殖能力、遷移能力及克隆形成能力。2.轉(zhuǎn)染外源性GFP-LC3質(zhì)粒用于觀察二氫青蒿素作用于HepG2.2.15細胞后LC3發(fā)生的轉(zhuǎn)位,β-gal染色實驗檢測二氫青蒿素作用于HepG2.2.15細胞后細胞的衰老狀況;3.Western Blot檢測二氫青蒿素作用于肝癌細胞HepG2.2.15后,PI3K/AKT/mTOR細胞信號通路中AKT,mTOR,p70S6K,4EBP1的磷酸化蛋白水平以及自噬相關(guān)蛋白LC3,p-AMPK,p62的表達差異;DDR信號通路中p-ATM,γ-H2AX,p53,p21表達情況;細胞端粒保護蛋白TPP1的表達水平;4.構(gòu)建含靶向TPP1的慢病毒介導的sh RNA表達質(zhì)粒PHBLV-U6-PURO-shTPP1(簡稱shTPP1);shTPP1感染HepG2.2.15細胞,Western Blot及Real-time PCR檢測shTPP1對HepG2.215細胞TPP1的蛋白及mRNA表達的抑制作用。5.抑制TPP1表達后,用結(jié)晶紫實驗、Transwell實驗、細胞劃痕實驗、平板克隆形成實驗及軟瓊脂糖克隆形成實驗檢測HepG2.2.15細胞的增殖、遷移及克隆形成能力的變化;Western Blot檢測DDR信號通路中p-ATM,γ-H2AX,p53,p21的表達,PI3K/AKT/mTOR信號通路中AKT,mTOR,p70S6K,4EBP1的磷酸化蛋白水平的表達,細胞自噬相關(guān)蛋白LC3,pAMPK,p62的表達水平。結(jié)果:1.二氫青蒿素作用于HepG2.2.15后細胞的生長、增殖、遷移及克隆形成能力明顯下降;2.二氫青蒿素能促進HepG2.2.15細胞中外源性GFP-LC3蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)位;3.β-gal染色實驗結(jié)果顯示二氫青蒿素能誘導HepG2.2.15細胞衰老;4.Western Blot結(jié)果顯示二氫青蒿素下調(diào)HepG2.2.15細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路中p-AKT,p-m TOR,p-p70S6K,p-4EBP1的表達;上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3,p-AMPK,p62以及DDR信號通路中p-ATM,p-ATR,γ-H2AX,p53,p21蛋白的表達。5.二氫青蒿素明顯下調(diào)Hep G2.2.15細胞端粒保護蛋白TPP1表達水平;6.瓊脂糖凝膠電泳及DNA測序顯示shTPP1質(zhì)粒構(gòu)建成功,Western Blot及Real-time PCR結(jié)果顯示shTPP1能有效抑制Hep G2.2.15細胞TPP1蛋白及mRNA表達水平;7.利用shTPP1抑制TPP1表達后,HepG2.2.15細胞的生長、增殖、遷移及克隆形成能力明顯下降;DDR信號通路中p-ATM,γ-H2AX,p53,p21蛋白及自噬相關(guān)蛋白LC3,p AMPK,p62表達增加;PI3K/AKT/mTOR信號通路中p-AKT,p-mTOR,p-p70S6K,p-4EBP1蛋白表達降低。結(jié)論:1.二氫青蒿素在肝癌細胞中具有顯著抗腫瘤作用;2.二氫青蒿素在肝癌細胞中抗腫瘤作用機制可能為:抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導細胞自噬;下調(diào)端粒保護蛋白TPP1的表達,激活DDR信號通路誘導細胞衰老等。3.二氫青蒿素可能作為肝癌治療潛在的抗腫瘤藥物,對于臨床應(yīng)用還需進一步深入研究和驗證。
【學位授予單位】：川北醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

A B圖 1. 二氫青蒿素對肝癌 HepG2.2.15 細胞的生長的影響。注：DMSO:對照組，DHA:實驗組。A. DMSO 和二氫青蒿素處理肝癌 HepG2.2.15 細胞 24 h 和 48 h后細胞的生長情況（X200）。B. 不同濃度的 DHA 作用于肝癌 HepG2.2.15 細胞不同時間后抑制作用的變化。

B二氫青蒿素對肝癌細胞 HepG2.2.15 增殖活力的影響 。DHA：實驗組。A.結(jié)晶紫染色法繪制生長曲線檢測二。B.DMSO 和 DHA 處理 48 h 后經(jīng)結(jié)晶紫染色后掃描六孔肝癌細胞 HepG2.2.15 遷移能力的影響癌細胞 HepG2.2.15 后，利用 Transwell 實能力的影響。顯微鏡下觀察和多視野計數(shù)細胞穿過數(shù)量明顯低于 DMSO 處理組(圖行計數(shù)后統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，差異具有統(tǒng)計學意驗觀察 DHA 處理組和 DMSO 處理組細胞遷移的距離，同樣顯示 DHA 處理組細胞遷

C圖 3. 二氫青蒿素抑制肝癌細胞 HepG2.2.15 的遷移能力。注：DMSO：對照組，DHA：實驗組。A. Transwell 實驗檢測二氫青蒿素對肝癌細胞 HepG2.遷移能力的影響( X200)，紅色箭頭指示穿過 Transwell 小室的 HepG2.2.15 細胞。B.Transwell 小室的 HepG2.2.15 細胞定量分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以 mean ± SD 作圖，N=3。**p＜0

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 郭瑋;孫云帆;潘柏申;樊嘉;;循環(huán)腫瘤細胞檢測及臨床應(yīng)用價值[J];中華臨床實驗室管理電子雜志;2014年03期

2 王紅鈺;王愛軍;鄭寶軍;馮俊偉;施華;吳肖;;二氫青蒿素誘導胃癌SGC7901細胞體外自噬研究[J];廣東醫(yī)學;2012年22期

3 陳建國;;中國肝癌發(fā)病趨勢和一級預(yù)防[J];臨床肝膽病雜志;2012年04期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 郭曉蘭;端粒功能異常誘導的DNA損傷反應(yīng)及其在腫瘤發(fā)生中的作用與分子機制[D];重慶醫(yī)科大學;2010年

本文編號：2751915