【摘要】：研究目的:1、研究VEGFR2抑制劑阿帕替尼對人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生長的影響。2、通過體外實驗和BALB/c免疫缺陷小鼠甲狀腺乳頭狀癌移植瘤模型體內(nèi)實驗研究阿帕替尼對甲狀腺乳頭狀癌的治療作用及其機制。3、探索自噬在阿帕替尼處理甲狀腺癌細(xì)胞中的作用以及機制,以及自噬抑制劑與阿帕替尼聯(lián)合應(yīng)用對甲狀腺乳頭狀細(xì)胞癌生長的影響及其機制。研究方法:1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測甲狀腺乳頭狀癌患者組織中VEGFR2的表達水平及與臨床相關(guān)性。采用q-PCR及Western-blot方法檢測甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織及正常組織中VEGFR2 mRNA及蛋白表達水平,以及不同甲狀腺細(xì)胞系中VEGFR mRNA及蛋白表達水平。2、通過CCK-8法檢測不同濃度及不同作用時間阿帕替尼對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K-1及KTC-1增殖的影響。利用劃痕實驗及Transwell實驗檢測阿帕替尼對腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。應(yīng)用Annexin V/PI雙染法檢測阿帕替尼對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凋亡的影響,應(yīng)用PI染色法檢測阿帕替尼對細(xì)胞周期的影響;并采用Western-blot法檢測阿帕替尼處理后K-1及KTC-1細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路蛋白及周期與凋亡相關(guān)蛋白水平的變化。3、通過建立BALB/c免疫缺陷小鼠甲狀腺乳頭狀癌移植瘤模型,檢測阿帕替尼對甲狀腺乳頭狀癌的體內(nèi)作用。4、采用免疫熒光法檢測經(jīng)阿帕替尼處理后甲狀腺癌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達情況,通過透射電鏡觀察阿帕替尼處理后甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K-1及KTC-1細(xì)胞胞漿中自噬小體形成情況;阿帕替尼聯(lián)合自噬抑制劑氯喹(HCQ)處理細(xì)胞后采用Western-blot方法檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達水平。5、應(yīng)用自噬抑制劑3-MA聯(lián)合阿帕替尼處理細(xì)胞后,通過免疫熒光法檢測胞漿中LC3B的表達情況,應(yīng)用透射電鏡觀察自噬小體形成情況,明確甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞自噬水平,并采用Annexin V/PI雙染法檢測阿帕替尼與3-MA聯(lián)合應(yīng)用對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞凋亡的影響;過Western-blot法檢測自噬相關(guān)蛋白及凋亡蛋白的表達水平。6、通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA ATG5下調(diào)自噬相關(guān)基因ATG5的表達,再次應(yīng)用DMSO及阿帕替尼處理兩組細(xì)胞,并應(yīng)用Western-blot法檢測自噬相關(guān)蛋白及凋亡蛋白的表達水平。結(jié)果:1、甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織中的VEGFR2的表達水平明顯高于癌旁正常組織,且VEGFR2的表達水平與腫瘤大小、癌灶個數(shù)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K-1及KTC-1 VEGFR2的mRNA及蛋白表達水平明顯高于正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy Ori3-1。2、以甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K-1及KTC-1為研究對象,CCK-8結(jié)果顯示阿帕替尼對于K-1及KTC-1均有抑制增殖的作用,且呈濃度及時間依賴性。劃痕實驗及Transwell實驗結(jié)果顯示阿帕替尼可以抑制K-1及KTC-1的遷徙和侵襲�？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示阿帕替尼可以抑制K-1及KTC-1的克隆形成能力,并呈濃度依賴性。通過AnnexinV/PI雙染法檢測實驗表明阿帕替尼可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及G0/G1期周期阻滯,并呈濃度依賴性。Western-blot顯示在蛋白水平,阿帕替尼可導(dǎo)致Akt磷酸化水平下降,同時凋亡蛋白cleaved-PARP、Bax表達上調(diào),凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調(diào),以及周期蛋白CyclinDl下調(diào)及P21上調(diào)。3、以BALB/c免疫缺陷小鼠為研究對象,應(yīng)用甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K-1建立移植瘤模型,待皮下腫瘤生長至3*3*3mm3,阿帕替尼100mg/kg/天連續(xù)灌胃4周,停藥后觀察2周,結(jié)果顯示與對照組相比,阿帕替尼組小鼠移植瘤明顯縮小。免疫組織化學(xué)染色顯示阿帕替尼組小鼠組織中VEGFR2、Ki-67表達下調(diào)。4、以甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K-1及KTC-1為研究對象,免疫熒光染色顯示阿帕替尼處理后細(xì)胞胞漿中自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達量明顯增加,透射電鏡下觀察細(xì)胞胞漿中自噬小體明顯增加。Western-blot結(jié)果顯示,阿帕替尼聯(lián)合自噬抑制劑HCQ處理組細(xì)胞LC3B表達下降,自噬底物P62表達上調(diào),凋亡蛋白cleaved-PARP表達上調(diào)。5、以甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系K-1為研究對象,應(yīng)用阿帕替尼處理細(xì)胞后,應(yīng)用自噬抑制劑3-MA抑制自噬,應(yīng)用Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示3-MA明顯增強了阿帕替尼誘導(dǎo)K-1凋亡的能力,而單獨用藥并不能導(dǎo)致K-1的凋亡。Western-blot蛋白檢測結(jié)果顯示,應(yīng)用3-MA降低了 LC3B的表達,阿帕替尼與3-MA聯(lián)合應(yīng)用組上調(diào)了 cleaved-PARP的表達,下調(diào)了 Bcl-2的表達。6、通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA ATG5特異性干擾ATG5的表達抑制自噬,再聯(lián)合應(yīng)用阿帕替尼處理細(xì)胞,通過Western-blot蛋白檢測結(jié)果顯示,ATG5表達受抑制組細(xì)胞,應(yīng)用阿帕替尼處理,凋亡蛋白cleaved-PARP的表達明顯上調(diào)。結(jié)論:1、甲狀腺乳頭狀癌組織中VEGFR2表達水平比正常甲狀腺組織高,且于腫瘤大小、多灶性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2、體內(nèi)及體外實驗證實阿帕替尼可以抑制甲狀腺乳頭狀癌生長,促進凋亡。3、阿帕替尼可以誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞保護性自噬,自噬抑制劑與阿帕替尼聯(lián)合應(yīng)用可進一步抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)PARP/Bcl-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R736.1
【圖文】：

用＇邋Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ邋Ｐｌｕｓ判定結(jié)果ｆ〔總，０分、１分為低表達．；２分、３分為：痛表達逡逑組，行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ＶＥＧＦＲ２陽性患者８６例，陰性患者１０１例，ＶＥＧＦＲ２逡逑陽性率為４６．０％，Ｐ邋＝邋０．０００，見表１．１，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖１．２。逡逑表１．１、１８７例甲狀腺乳頭狀癌患者ＶＥＧＦＲ２免疫組化染色結(jié)果逡逑＾ＥＧＦＲ２表達水乎正常甲狀腺組織邐甲狀腺乳頭狀癌組織’逡逑０邋分邐２２邐（５１．２％＞邐３３邐Ｕ７．６％）逡逑１邋分邐１９（４４．２％）邐６８邐（３６．４％）逡逑２邋分邐２邐Ｃ４．６％）邐４４邐Ｑ３．５％）逡逑３邋分邐０邐（０．０％）邐４２邐（２２．５％）邐逡逑１００－１逡逑８０－邋＾逡逑Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅ邋Ｐａｒａｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑□邋ＶＥＧＦＲ２邋ｈｉｇｈ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋■邋ＶＥＧＦＲ２邋ｌｏｗ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑圖１．２、兩組結(jié)果經(jīng)卡方檢驗，Ｐ＜０．０１，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義逡逑１７逡逑

ｉ邋．邐：…？？二＼逡逑Ｌ■b\0肩逡逑ｇ＇ｄ邋．．逡逑圖１．１、甲狀腺乳頭狀癌患者組織中ＶＥＧＦＲ２的表達逡逑用＇邋Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ邋Ｐｌｕｓ判定結(jié)果ｆ〔總，０分、１分為低表達．；２分、３分為：痛表達逡逑組，行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ＶＥＧＦＲ２陽性患者８６例，陰性患者１０１例，ＶＥＧＦＲ２逡逑陽性率為４６．０％，Ｐ邋＝邋０．０００，見表１．１，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖１．２。逡逑表１．１、１８７例甲狀腺乳頭狀癌患者ＶＥＧＦＲ２免疫組化染色結(jié)果逡逑＾ＥＧＦＲ２表達水乎正常甲狀腺組織邐甲狀腺乳頭狀癌組織’逡逑０邋分邐２２邐（５１．２％＞邐３３邐Ｕ７．６％）逡逑１邋分邐１９（４４．２％）邐６８邐（３６．４％）逡逑２邋分邐２邐Ｃ４．６％）邐４４邐Ｑ３．５％）逡逑３邋分邐０邐（０．０％）邐４２邐（２２．５％）邐逡逑１００－１逡逑８０－邋＾逡逑Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅ邋Ｐａｒａｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑□邋ＶＥＧＦＲ２邋ｈｉｇｈ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋■邋ＶＥＧＦＲ２邋ｌｏｗ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑圖１．２、兩組結(jié)果經(jīng)卡方檢驗，Ｐ＜０．０１，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義逡逑１７逡逑

織樣本中的ＶＥＧＦＲ２的表達水平進行檢測，實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，逡逑所有數(shù)據(jù)至少重復(fù)三次，結(jié)果顯示，與癌旁正常甲狀腺組織相比，甲狀腺乳頭逡逑狀癌組織中ＶＥＧＦＲ２的表達水平明顯升高ｙ如圖１．３所示逡逑Ｃ逡逑．２邋＊＊＊邋Ｔ逡逑Ｉ邋０．０３－，邐邐邋？邋ＴｕｎＷ逡逑＾邐ｔ邐0邐Ｐｅｒｉ－ｔｕｍｏｒ逡逑ｏ邐ｔ逡逑ｚ邋０邋０２－逡逑％逡逑ｃｓ邐逡逑￡邋０．０１－逡逑§＞邐？？？？邐00ｎＡｎ00逡逑＝０．００－Ｉ邐１邐０ｆＴｗ＾ｎｆｌ°邐逡逑＾邐Ｔｕｍｏｒ邐Ｐｅｒｉ－ｔｕｍｏｒ逡逑圖１．３、甲狀腺乳頭狀癌組織中ＶＥＧＦＲ２的實時熒光定量ＰＣＲ的檢測結(jié)果逡逑為驗證此結(jié)論，本研究隨機選取３名甲狀腺乳頭狀患者的癌組織及癌旁ｉｇ逡逑�？�，提取組織總蛋白，行蛋白質(zhì)電泳（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）檢測，結(jié)果顯示，３逡逑例患者癌組織中的ＶＥＧＦＲ２的表達水平明V錘哂詘┡宰櫓繽跡保此懼義希危卞澹危插澹危沖澹裕卞澹裕插澹裕沖義希鄭牛牽疲遙插義希牽粒校模儒義賢跡保礎(chǔ)⒓鬃聰偃橥紛窗┳櫓校鄭牛牽疲遙駁模祝錄觳飩峁義希保玻澹村澹鄭牛牽疲遙蒼詡鬃聰儐赴抵械謀澩镥義銜嗣魅罰鄭牛牽疲遙蒼詡鬃聰儐赴抵校恚遙危戀謀澩鎪劍τ糜τ檬凳卞義嫌舛╢垼海校茫遙ǎ遙澹幔歟簦椋恚邋澹校茫遙┘觳餳鬃聰侔┫赴靛澹攏茫校粒�、Ｋ－１、ＴＰＣ－１、ＫＴＣ－１、辶x希茫幔歟叮�、８�(dān)埃擔(dān)眉罷＜鬃聰俾伺萆掀は赴危簦瑁希潁椋常熘校鄭牛牽疲遙玻恚遙危簾澩镥義纖劍峁允炯鬃聰偃橥紛窗┫赴擔(dān)耍奔埃耍裕茫鋇模鄭牛牽疲遙插澹恚遙危簾澩鎪義掀澆險Ｂ伺萆掀は赴危簦瑁澹希潁椋常焐

本文編號：2750768