發(fā)布時(shí)間：2020-07-11 16:52

【摘要】：真核生物的基因表達(dá)調(diào)控不僅包括轉(zhuǎn)錄層面上的調(diào)控,同時(shí)也包含轉(zhuǎn)錄后對(duì)前體mRNA的加工過(guò)程,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控決定著細(xì)胞的命運(yùn)。RNA的可變剪接是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要機(jī)制,隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,如何從測(cè)序后得到的大規(guī)模生物學(xué)數(shù)據(jù)和公眾組學(xué)數(shù)據(jù)資源中,篩選出具有生物學(xué)特征和規(guī)律的數(shù)據(jù)集,深入挖掘可變剪接調(diào)控與疾病之間的關(guān)系已經(jīng)成為后基因組時(shí)代亟待研究的前沿問(wèn)題。近年研究表明,可變剪接是共轉(zhuǎn)錄剪接過(guò)程,不僅受到RNA結(jié)合剪接因子的調(diào)控,而且表觀遺傳調(diào)控元件,例如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、核小體密度和組蛋白修飾等也參與可變剪接的過(guò)程。異常的可變剪接會(huì)造成細(xì)胞異常分化和生理功能失調(diào),促使包括癌癥在內(nèi)的多種疾病發(fā)生。本論文主要針對(duì)表觀遺傳修飾H3K79me2在人類多種組織的正常和疾病細(xì)胞進(jìn)行可變剪接位點(diǎn)富集度研究,內(nèi)容包括以下幾方面:首先,利用高通量測(cè)序技術(shù)和已有的開(kāi)源性數(shù)據(jù)資源,創(chuàng)建34種人類不同組織正常和疾病細(xì)胞H3K79me2的ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)集。借助計(jì)算機(jī)模擬技術(shù),分別對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行H3K79me2的富集峰分析和可變剪接事件分析。根據(jù)計(jì)算出的ψ-value,分別創(chuàng)建五種可變剪接模型。整合數(shù)據(jù)集分析結(jié)果,闡述H3K79me2在不同可變剪接模型的可變剪接位點(diǎn)區(qū)域富集特征。我們發(fā)現(xiàn)H3K79me2富集水平較高的兩個(gè)可變剪接類型,即外顯子跳讀事件和3’端可變剪接事件。從ψ-value的分布特征將細(xì)胞層級(jí)聚類后初步發(fā)現(xiàn),癌癥細(xì)胞,包括惡性血液疾病細(xì)胞,與正常細(xì)胞的圖譜具有顯著性差異。初步推測(cè),H3K79me2通過(guò)對(duì)可變剪接調(diào)控在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。其次,以發(fā)現(xiàn)的五種可變剪接模式中占主導(dǎo)位置的外顯子跳讀事件為研究對(duì)象,通過(guò)自組織映射神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),按照H3K79me2富集特征將34種人類細(xì)胞聚類,進(jìn)一步闡述外顯子跳讀事件與細(xì)胞特異性之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)兩種聚類類群,其中一種聚類主要包含髓系白血病細(xì)胞系,特別是MLL-r急性髓系白血病細(xì)胞。另一種聚類包括大多數(shù)淋巴細(xì)胞白血病類型細(xì)胞。并且根據(jù)千堿基H3K79me2富集的讀長(zhǎng)數(shù)檢測(cè)和與非可變剪接位點(diǎn)富集程度對(duì)比,發(fā)現(xiàn)在第一種聚類中,H3K79me2在可變剪接位點(diǎn)區(qū)域富集的讀長(zhǎng)數(shù)最多,富集水平最高。我們的研究結(jié)果首次從全基因組水平角度揭示H3K79me2在MLL-r急性髓系血病細(xì)胞中富集度較高的原因,即外顯子跳讀剪接是連接表觀遺傳修飾H3K79me2和MLL-r急性髓系白血病之間的重要紐帶。之后,為了從基因表達(dá)水平說(shuō)明H3K79me2對(duì)可變剪接的調(diào)控機(jī)制,分別對(duì)外顯子跳讀事件位點(diǎn)相關(guān)基因和隨機(jī)選擇的一系列非外顯子跳讀事件位點(diǎn)基因進(jìn)行基因表達(dá)水平和富集通路分析。從基因水平分析結(jié)果中,可變剪接組和對(duì)照組基因表達(dá)水平并未發(fā)現(xiàn)具有顯著性差異,說(shuō)明H3K79me2的富集程度對(duì)可變剪接的調(diào)控并不會(huì)影響整體mRNA的表達(dá)量。通路富集分析進(jìn)一步揭示H3K79me2調(diào)控的外顯子跳讀事件相關(guān)基因在MLL-r急性髓系白血病和慢性髓系白血病細(xì)胞中,參與著血液癌癥惡化的生物學(xué)過(guò)程。此外,我們還篩選出調(diào)控外顯子跳讀事件的關(guān)鍵結(jié)合蛋白和剪接因子,繪制剪接因子結(jié)合圖譜,從結(jié)合圖譜上發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的兩個(gè)與MLL-r急性髓系白血病關(guān)系密切的剪接因子SRSF2和U2AF2更傾向于結(jié)合在跳讀外顯子結(jié)束區(qū)域。最后,對(duì)六種血液細(xì)胞中的多個(gè)外顯子跳讀位點(diǎn)進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)中得到的外顯子跳讀位點(diǎn)與預(yù)期結(jié)果吻合,并具有高度的細(xì)胞/疾病特異性。進(jìn)一步通過(guò)抑制H3組蛋白79位賴氨酸的唯一甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L基因表達(dá),可以顯著降低外顯子跳讀事件相關(guān)區(qū)域的H3K79me2的修飾水平,導(dǎo)致外顯子跳讀事件降低或消失,剪接優(yōu)勢(shì)異構(gòu)體從外顯子跳讀異構(gòu)體轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型剪接異構(gòu)體。而本文中發(fā)現(xiàn)的DOT1L對(duì)MLL-r重排髓系白血病亞型效果顯著,H3K79me2水平的降低逆轉(zhuǎn)了AML-MLL-r細(xì)胞中的特異性可變剪接。同時(shí)白血病AML-MLL-r細(xì)胞亞型的細(xì)胞增殖受到限制,證實(shí)了特異性的可變剪接與細(xì)胞增殖密切相關(guān),也闡明了表觀遺傳標(biāo)記H3K79me2參與外顯子跳讀過(guò)程的調(diào)控對(duì)白血病MLL-AML亞型的重要作用,為靶向DOT1L抑制劑的臨床患者亞型分類提供應(yīng)用線索。本論文的研究首次從全基因組水平揭示H3K79me2通過(guò)共轉(zhuǎn)錄剪接機(jī)制,在疾病,特別是惡性血液疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能性調(diào)控作用。闡述表觀遺傳修飾、外顯子跳讀可變剪接事件、關(guān)鍵性剪接因子和惡性白血病的調(diào)控關(guān)系,梳理出表觀遺傳調(diào)控—分子生物學(xué)機(jī)制—疾病的發(fā)生發(fā)展之間的調(diào)控主線。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733
【圖文】：

圖 1-1 ChIP-seq 流程示意圖Figure 1-1 Process of ChIP-seq圍繞 ChIP-seq 技術(shù)基本原理，逐漸更新發(fā)展著分辨率更高或者用途更為廣泛的實(shí)驗(yàn)學(xué)手段。Chen 等在進(jìn)行 ChIP-exo 實(shí)驗(yàn)后分析大數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子如何尋找以及如何聚集到同源 DNA 靶點(diǎn)位置[43]。由于 ChIP-seq 技術(shù)對(duì)抗體的要求較高，抗體的特異性會(huì)直接影響測(cè)序結(jié)果的有效性和分析階段背景信號(hào)的強(qiáng)弱。針對(duì)大部分商用抗體會(huì)導(dǎo)致測(cè)序數(shù)據(jù)不符合計(jì)算機(jī)識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)，形成過(guò)多的雜峰問(wèn)題。Savic 等結(jié)合 CRISPR 技術(shù)，在抗體質(zhì)量問(wèn)題上對(duì) ChIP-seq 技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，并將改進(jìn)后的新技術(shù)命名為 CETCh-seq[44]。Steube 等利用高強(qiáng)度的紫外線激光照射活細(xì)胞后進(jìn)行免疫共沉淀測(cè)序（UV-ChIP-seq）實(shí)驗(yàn)學(xué)技術(shù)，在全基因組水平上發(fā)現(xiàn)人類彌漫性大B細(xì)胞淋巴癌的特異性轉(zhuǎn)錄抑制子BCL6，以及其精確的蛋白質(zhì)與 DNA 結(jié)合特征，并且在通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果的預(yù)測(cè)分析中，挖掘出 BCL6 在染色質(zhì)難以探測(cè)處的結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)是以前從

圖 2-2 微流體電泳儀對(duì) DNA 文庫(kù)長(zhǎng)度檢測(cè)Figure 2-2 ChIP-DNA library size detection by bioanalyzer其中上方左側(cè)圖為電泳條帶測(cè)量結(jié)果，Marker 為標(biāo)準(zhǔn)梯度，條帶下方數(shù)字1、2 對(duì)應(yīng)右側(cè)峰圖中的 LNCap_1 和 LNCap_2 樣品，所代表的分別為 LNCap 細(xì)胞經(jīng)過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀后得到的 DNA 文庫(kù)的兩組平行樣品，同理數(shù)字 3，4為 MV-4-11 細(xì)胞的 H3K79me2 組蛋白修飾 ChIP 后的 DNA 文庫(kù)平行樣品。從電泳片段條帶上看，所有樣品的電泳條帶都集中在 300 bp 附近，位于我們的期望條帶區(qū)域。峰圖可以清晰看到，絕大部分的條帶在 300 bp 上下位置形成峰頂。LNCap_1 組文庫(kù) DNA 樣品，有 97%的峰位于 200 bp 到 1000 bp 之間，平均條帶為 313 bp，峰值最高點(diǎn) 294 bp；其平行樣品 LNCap_2 樣品，95%在 200 bp 到1000 bp，平均條帶為 328 bp，峰值最高 304 bp，平行測(cè)序樣品 DNA 片段大小之間無(wú)顯著性差異。同樣，MV-4-11 細(xì)胞構(gòu)建的文庫(kù)，兩組分別有 92%和 91%的峰位于 200bp到 1000bp范圍內(nèi)，MV-4-11_1 文庫(kù)的平均片段大小為 307bp，最

代碼分別如下：index_gff --index /home/reference/Shg19/indexed_SE_events/ ； index_gff --index /home9.gff3 /data/SE_hg19/indexed_MXE_events/ ； index_gff --in/RI.hg19.gff3 /data/SE_hg19/indexed_RI_events/；index_gff --in/A3SS.hg19.gff3 /data/SE_hg19/indexed_A3SS_events/；indexerence/A5SS.hg19.gff3 /data/SE_hg19/indexed_A5SS_events/。，根據(jù)參考注釋建立的索引文件，在 linux 操作環(huán)境下運(yùn)行 入：miso --run /data/SE_hg19/indexed_SE_events/ LNCaP_R /data/MISO/miso_LNCaP_SE --read-len 51 -p 30。其中，--o文件夾；--read-len 表示測(cè)序讀長(zhǎng)的長(zhǎng)度；-p 30 即使用的 C，提煉重要信息，得到樣本的統(tǒng)計(jì)概要。代碼為：summare-samples /data/MISO/miso_LNCaP_SE/ /data/MISO/summaries_

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本文編號(hào)：2750672