發(fā)布時(shí)間：2020-07-11 15:32

【摘要】：目的:通過向體外條件培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨前體細(xì)胞施加力學(xué)載荷,建立前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞力學(xué)生物學(xué)模型;篩選出前列腺癌骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致病理性成骨分化細(xì)胞的差異表達(dá)mRNA和miRNA(微小RNA);篩選預(yù)測(cè)病理性成骨分化相關(guān)的信號(hào)分子和信號(hào)通路;預(yù)測(cè)防控前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所致病理性成骨分化或骨形成的分子靶標(biāo),探討前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所致病理性成骨分化的機(jī)理。方法:1.以前列腺癌PC-3細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1,同時(shí)采用四點(diǎn)彎曲加載裝置向以上成骨前體細(xì)胞施加2500με的周期性力學(xué)載荷,作為細(xì)胞病理性成骨分化組(病理組);向未經(jīng)條件培養(yǎng)液處理的成骨前體細(xì)胞施加2500με的周期性載荷,作為細(xì)胞生理性成骨分化組(生理組)。2.檢測(cè)相關(guān)成骨分化指標(biāo),建立前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所致病理性成骨分化的細(xì)胞模型。3.采用高通量測(cè)序技術(shù),篩選病理性和生理性成骨分化狀態(tài)細(xì)胞的差異表達(dá)miRNA,并以qRT-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)驗(yàn)證。4.采用數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序,篩選生理組和病理組差異表達(dá)mRNA,采用基因聚類分析、GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,篩選與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞所致病理性成骨分化相關(guān)的基因以及關(guān)鍵信號(hào)途徑,預(yù)測(cè)與病理性成骨相關(guān)的分子靶點(diǎn)和信號(hào)途徑。結(jié)果:1.相對(duì)于生理組,病理組的堿性磷酸酶活性和染色、成骨分化相關(guān)基因/蛋白(Runx 2(Runt-相關(guān)蛋白-2)、I型膠原、骨鈣素)表達(dá)量均下調(diào)(*P0.05)。2.采用高通量測(cè)序技術(shù),篩選出51個(gè)差異表達(dá)的miRNA;q RT-PCR驗(yàn)證其中差異顯著的24個(gè)miRNA,發(fā)現(xiàn)7個(gè)miRNAs上調(diào),12個(gè)miRNAs下調(diào),且qRT-PCR與測(cè)序篩選結(jié)果相符。3.采用基因聚類分析、GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析和KEGG Pathway分析,篩選出可能與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移所致病理性成骨分化相關(guān)的基因以及關(guān)鍵信號(hào)途徑。結(jié)論:成骨細(xì)胞在生理力學(xué)載荷下,PC-3條件培養(yǎng)液培養(yǎng)抑制成骨細(xì)胞的成骨分化,建立了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞力學(xué)生物學(xué)模型;在此模型基礎(chǔ)上,篩選并驗(yàn)證7個(gè)上調(diào)、12個(gè)miRNAs下調(diào)的miRNA,篩選出WNT、MAPK、TNF等8條信號(hào)途徑及相關(guān)基因、miRNA很可能與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致病理性成骨分化相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

四點(diǎn)彎曲力學(xué)加載裝置；B：裝置簡(jiǎn)圖：加載時(shí)，細(xì)胞 Four-point bending device for application of mechanical B:Device diagram: cell tension during loading培養(yǎng)單元的消毒膠對(duì)培養(yǎng)空間和加載板子進(jìn)行黏合處理，確中不出現(xiàn)培養(yǎng)基泄漏；硅橡膠處理過的加載H 溶液過夜浸泡；清水清洗、晾干，接著使取出晾干，再使用清水過夜浸泡，撈出、晾酒精小心擦拭以后，放入超凈工作臺(tái)，打開干加載板孔。細(xì)胞種板

圖 2A MC3T3-E1 成骨細(xì)胞培養(yǎng)（10 X） 圖 2B PC-3 細(xì)胞培養(yǎng)（10 X）Figure 2A Culture of MC3T3-E1(10 X） Figure 2B Culture of PC-3 (10 X）2.2 成骨細(xì)胞分化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)分別采用市售試劑盒，檢測(cè)堿性磷酸酶活性和染色；熒光定量 PCR檢測(cè)或免疫印跡法檢測(cè)成骨分化相關(guān) mRNA/蛋白（Runx-2、I 型膠原、骨鈣素）；茜素紅染色細(xì)胞外基質(zhì)的鈣質(zhì)沉積。2.2.1 力學(xué)刺激下條件培養(yǎng)的成骨前體細(xì)胞 ALP 檢測(cè)細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于加載孔中，待細(xì)胞完全融合后，分別給細(xì)胞施加周期性力學(xué)載荷，病理組同時(shí)用 PC-3 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天予以更換培養(yǎng)液。加載第三天后，檢測(cè)各組細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)差異，如圖3，病理組較生理組堿性磷酸酶活性明顯減少。

圖 2A MC3T3-E1 成骨細(xì)胞培養(yǎng)（10 X） 圖 2B PC-3 細(xì)胞培養(yǎng)（10 X）Figure 2A Culture of MC3T3-E1(10 X） Figure 2B Culture of PC-3 (10 X）2.2 成骨細(xì)胞分化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)分別采用市售試劑盒，檢測(cè)堿性磷酸酶活性和染色；熒光定量 PCR檢測(cè)或免疫印跡法檢測(cè)成骨分化相關(guān) mRNA/蛋白（Runx-2、I 型膠原、骨鈣素）；茜素紅染色細(xì)胞外基質(zhì)的鈣質(zhì)沉積。2.2.1 力學(xué)刺激下條件培養(yǎng)的成骨前體細(xì)胞 ALP 檢測(cè)細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于加載孔中，待細(xì)胞完全融合后，分別給細(xì)胞施加周期性力學(xué)載荷，病理組同時(shí)用 PC-3 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天予以更換培養(yǎng)液。加載第三天后，檢測(cè)各組細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)差異，如圖3，病理組較生理組堿性磷酸酶活性明顯減少。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉復(fù)州;邱浩;王汝杰;鄒傳奇;劉栓得;胡旭;沈偉偉;張超;周躍;初同偉;;不同前列腺癌細(xì)胞對(duì)成骨前體細(xì)胞增殖和成熟能力的影響[J];腫瘤;2013年12期

2 湯元杰;孫穎浩;許傳亮;王林輝;高旭;劉冰;紀(jì)家濤;;前列腺癌PC-3細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響[J];中華男科學(xué)雜志;2011年03期

3 閆玉仙;宋梅;郭春;郭勇;宮元偉;李瑞欣;張西正;;基底拉伸應(yīng)變對(duì)小鼠三種骨組織細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)的影響[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2010年21期

本文編號(hào)：2750592