【摘要】：目的:構(gòu)建過(guò)表達(dá)抑癌基因miR-204-5p的HEK-293T(293T)穩(wěn)轉(zhuǎn)株,并收集其富含miR-204-5p的外泌體(exosome),在體內(nèi)外水平驗(yàn)證外泌體miR-204-5p對(duì)結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)細(xì)胞增殖和凋亡的作用,為CRC的治療提供新思路。方法:構(gòu)建miR-204-5p過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒pWPXL-miR-204,通過(guò)慢病毒包裝構(gòu)建HEK-293T穩(wěn)轉(zhuǎn)株293T-pWPXL-GFP(293T-GFP)、293T-pWPXL-miR-204(293T-miR-204);采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證miR-204-5p在穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞293T-miR-204,及其外泌體中的表達(dá);采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證CRC細(xì)胞LoVo、HCT116分別與HCT116-pWPXL-miR-204(HCT116-miR-204),293T-miR-204培液上清的條件培養(yǎng)基和外泌體共培養(yǎng)后的miR-204-5p表達(dá)水平;將CRC細(xì)胞分別與293T-miR-204、293T-GFP培液上清的條件培養(yǎng)基和外泌體共培養(yǎng),再采用CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC細(xì)胞的增殖能力,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CRC細(xì)胞的凋亡情況,用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)CRC細(xì)胞中miR-204-5p靶基因RAB22A和BCL2的表達(dá);并用CCK-8法檢測(cè)與293T-miR-204的外泌體共培養(yǎng)后的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(MDB-231)、MCF-7,胃癌細(xì)胞SGC7901,肺癌細(xì)胞A549,腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖能力;裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)比較外泌體miR-204-5p對(duì)CRC移植瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng);免疫組化方法檢測(cè)裸鼠腫瘤組織中RAB22A和BCL2的表達(dá)。結(jié)果:(1)成功建立重組質(zhì)粒pWPXL-miR-204,并構(gòu)建293T穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-204-5p的細(xì)胞株293T-miR-204;與對(duì)照組293T-GFP相比,293T-miR-204細(xì)胞和外泌體中miR-204-5p的表達(dá)分別上調(diào)(2303.79±143.31)倍、(282.33±18.25)倍(P均0.001);(2)CRC細(xì)胞LoVo、HCT116與HCT116-miR-204細(xì)胞的培液上清共培養(yǎng)后細(xì)胞中miR-204-5p分別上調(diào)(253.88±9.21)倍、(275.78±9.58)倍,與293T-miR-204培液上清的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后細(xì)胞中miR-204-5p分別上調(diào)(283.37±16.81)倍、(338.09±24.31)倍,與HCT116-miR-204的外泌體共培養(yǎng)后上調(diào)(31.01±1.60)倍、(29.44±2.93)倍,與293T-miR-204的外泌體共培養(yǎng)后上調(diào)(30.89±4.65)倍、(41.97±6.23)(P均0.001);(3)CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)證明與293T-miR-204培液上清的條件培養(yǎng)基和外泌體共培養(yǎng)可抑制CRC細(xì)胞的增殖;(4)CCK-8實(shí)驗(yàn)證明293T-miR-204細(xì)胞的外泌體可抑制MDB-231和MCF-7、SGC7901、A549、U251細(xì)胞的增殖;(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與293T-miR-204培液上清的條件培養(yǎng)基和外泌體可促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡;(6)Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與293T-miR-204培液上清的條件培養(yǎng)基和外泌體共培養(yǎng)后,CRC細(xì)胞中miR-204-5p的下游靶基因RAB22A和BCL2的表達(dá)下調(diào);(7)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明外泌體miR-204-5p可抑制CRC移植瘤的生長(zhǎng);(8)免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證外泌體miR-204-5p可下調(diào)移植瘤腫瘤組織中RAB22A、BCL2的表達(dá)。結(jié)論:(1)成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-204-5p的細(xì)胞293T-miR-204,且miR-204-5p可被富集包裝入293T-miR-204細(xì)胞的外泌體中;(2)外泌體miR-204-5p可進(jìn)入CRC細(xì)胞并通過(guò)下調(diào)RAB22A、BCL2抑制其增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為外泌體作為抑癌基因miR-204-5p的載體用于CRC的治療提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.3
【圖文】：

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文腔內(nèi)堆積。存在于早期內(nèi)涵體中的分子可以被回收整合到質(zhì)膜上S 中[29]。內(nèi)容物分揀到 ILVS 的機(jī)制是由依賴于內(nèi)涵體分選轉(zhuǎn)運(yùn)dosomal sorting complexes required for transport dependent，ESCR早期內(nèi)涵體向內(nèi)出芽的方式堆積在晚期內(nèi)涵體，從而將內(nèi)涵體轉(zhuǎn)esicular bodies，MVBs）[33]。隨后這些 MVBs 與溶酶體融合后被釋放其內(nèi)部囊泡，如外泌體。重要的是，MVBs 的轉(zhuǎn)運(yùn)和與細(xì)胞ab 鳥(niǎo)苷三磷酸酶（GTPase）蛋白調(diào)控，并與細(xì)胞骨架和分子運(yùn)動(dòng)

圖 1-2 外泌體的生物合成與內(nèi)化機(jī)制，以及它在生理病理狀態(tài)發(fā)揮的作用ig. 1-2 Exosomal biogenesis and internalization mechanisms and their roles in physiological pathological processes.（2）分離與鑒定外泌體的分離純化主要基于免疫親和捕獲、聚合物沉淀、超速離心和微流控技技術(shù)原理并不是相互排斥的，它們的組合使用或許更有助于高效分離純化外這些分離方法，國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)提出的標(biāo)準(zhǔn)化程序可以提供詳細(xì)的指導(dǎo)[止，其中采用最為廣泛和最可靠的方法是超速離心，它包括一系列的離心步種方法繁瑣耗時(shí)，需要大量的生物樣品量。因此，商用聚合物沉淀試劑盒用于外泌體的分離[41]。這些方法采用 ExoQuick 和 TotalExosome 等分離試劑，耗時(shí)短，但產(chǎn)品純度低于超速離心法。目前仍舊無(wú)法完全分離或消除尺寸接近的不同類型 EVs，這表明外泌體的提一些小的 EVs 或其他成分，而非“純”的外泌體。免疫親和分離法可能會(huì)富的外泌體群體[42]，但這種方法的產(chǎn)量無(wú)法得到保證。最近，Heller 等人用交[43]。該裝置只需 30~50

第一章 緒論靶細(xì)胞，從而對(duì)其靶點(diǎn) mRNA 的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。然而，由于缺乏對(duì) EV 介導(dǎo)的 miRNA轉(zhuǎn)移功能的直接論證，因此該假設(shè)中包含不確定性。這一假說(shuō)的核心是原始轉(zhuǎn)錄本加工成能在受體細(xì)胞中直接發(fā)揮作用的活性 miRNAs 的過(guò)程只發(fā)生在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。然而，這一觀點(diǎn)正面臨一些挑戰(zhàn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 加工的關(guān)鍵成分 Dicer 和 Ago 2在外泌體中存在并可發(fā)揮功能[58]。雖然尚未證實(shí)，但這些發(fā)現(xiàn)表明，外泌體不僅是miRNA 被動(dòng)的載體，也可能是它的加工工廠。

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6 朱s

本文編號(hào)：2750510