【摘要】：研究背景胃癌是我們?nèi)祟愖畛Ｒ姷膼盒阅[瘤之一,是引起人類腫瘤死亡的常見原因。據(jù)報道雖然胃癌的發(fā)病率與死亡率一直處于下降趨勢,但探尋其防治和治療的方法仍然是世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的話題。由于我們?nèi)狈Π┣昂桶┌Y早期的診斷方法,病人常常錯失治療的最佳時期。目前對于胃癌患者首選的治療方式是手術(shù)切除,后期治療過程中輔助放療和化療,然而對其手術(shù)后的生存及預(yù)后進行追蹤發(fā)現(xiàn)效果并不樂觀。目前看來,浸潤轉(zhuǎn)移是當前腫瘤治療的瓶頸所在,一旦病變進入晚期或轉(zhuǎn)移階段,我們當前的治療策略基本上是無效的。因此迫切地的需要我們了解胃癌轉(zhuǎn)移的分子機理,以提高病人的預(yù)后。SIRT1是sirtuin家族的成員之一,是釀酒酵母中Sir2的哺乳動物同源物,而Sir2是酵母中第一個被發(fā)現(xiàn)的進化保守的長壽調(diào)控因子。SIRT1是Ⅲ型組蛋白去乙�；�,它依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)跟底物上的乙酰基結(jié)合從而發(fā)揮其去乙�；饔�,其底物不僅包括組蛋白,還包括非組蛋白。通過調(diào)控不同的靶基因,SIRT1的去乙�；饔门c能量代謝、自噬、炎癥和癌癥等生物學(xué)以及病理學(xué)過程有著密切聯(lián)系。然而由于腫瘤類型以及參與的信號通路不同,SIRT1在癌癥發(fā)展中的作用存在著爭議。我們先前的研究證明SIRT1在胃癌里的表達是下調(diào)的,它通過NF-κB/細胞周期蛋白D1信號通路,抑制胃癌中細胞周期蛋白D1的表達,進而誘導(dǎo)增殖中的胃癌細胞停滯于G1期,從而抑制胃癌的發(fā)展。過去諸多研究表明SIRT1與各類腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有著密切相關(guān)性。除增殖外,SIRT1還參與了癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移。SIRT1通過對Smad4發(fā)揮去乙�；饔�,進而抑制TGF-β信號通路中MMP7(Smad4的靶基因)的作用,這樣SIRT1在乳腺癌和口腔癌中就具有了抑制細胞的遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的意義。在肺癌和卵巢癌中,SUMO E3連接酶PIASy通過減少Spl與SIRT1啟動子的結(jié)合,抑制SIRT1的表達,進而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。也曾有報道,SIRT1促進癌基因——轉(zhuǎn)錄因子FOXM1蛋白酶體的降解,進而逆轉(zhuǎn)乳腺癌中營養(yǎng)傳感器 O-linked-β-N-acetylglucosamine(O-GlcNAc)轉(zhuǎn)移酶(OGT)介導(dǎo)的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而在胃癌中SIRT1對侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及其調(diào)控機制尚不清楚。在此次研究中,我們探究了 SIRT1在胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移中所發(fā)揮的作用及其下游靶基因。我們發(fā)現(xiàn)SIRT1在體內(nèi)、外都抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。接下來,我們通過mRNA微陣列技術(shù)對其下游靶基因進行篩選,并通過多種胃癌細胞系對篩選結(jié)果進行驗證,同時對SIRT1調(diào)控靶基因的具體機制進行了進一步探究。研究目的:探究SIRT1在胃癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中的功能及具體調(diào)控機制,為治療胃癌提供新的靶點。研究方法和結(jié)果:1.為了檢測SIRT1對胃癌細胞遷移和侵襲的影響,我們利用SIRT1過表達及干擾的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞(AGS、BGC-823、MGC-803、HGC-27、SGC-7901),通過劃痕實驗和Transwell(無/有基質(zhì)膠)實驗,我們發(fā)現(xiàn)SIRT1能有效地抑制胃癌細胞遷移和侵襲。2.在裸鼠體內(nèi),分別用胃癌細胞系BGC-823的SIRT1過表達和干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞及它們相應(yīng)的對照穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞進行裸鼠尾靜脈注射,四周后處死裸鼠,取肺,稱重,拍照,4%甲醛固定,HE染色,用于轉(zhuǎn)移檢查,我們發(fā)現(xiàn)在裸鼠體內(nèi)SIRT1可以抑制胃癌細胞向肺部轉(zhuǎn)移。3.為了在胃癌細胞中尋找SIRT1下游調(diào)控的基因,我們使用了 SIRT1過表達及干擾的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)BGC-823細胞及各自相應(yīng)的對照細胞進行mRNA微陣列技術(shù)檢測,對檢測中發(fā)現(xiàn)的差異表達基因在多種穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞系中選用qPCR技術(shù)及Western blot技術(shù)從mRNA和蛋白表達水平進行驗證,篩選出了 SIRT1負向調(diào)控的下游基因ARHGAP5。4.利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫JASPAR對ARHGAP5的啟動子序列進行分析,預(yù)測到了轉(zhuǎn)錄因子c-JUN和RELA在ARHGAP5的啟動子序列上的結(jié)合位點。在胃癌細胞系中轉(zhuǎn)染上述轉(zhuǎn)錄因子的小干擾,用qPCR技術(shù)及Western blot技術(shù)證明了是轉(zhuǎn)錄因子c-JUN而不是RELA參與了胃癌細胞中ARHGAP5的表達調(diào)控。在SIRT1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞中干擾c-JUN的表達,發(fā)現(xiàn)ARHGAP5的表達發(fā)生了明顯的回復(fù),進一步證實轉(zhuǎn)錄因子c-JUN參與了 SIRT1調(diào)控的ARHGAP5的表達。為了進一步證實這一結(jié)論,我們在SIRT1穩(wěn)轉(zhuǎn)的胃癌細胞中進行了雙熒光素酶實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT1抑制了 ARHGAP5啟動子活性,即SIRT1在轉(zhuǎn)錄水平抑制了 ARHGAP5的表達。而且雙熒光素酶實驗還發(fā)現(xiàn)c-JUN在ARHGAP5啟動子序列上的結(jié)合位點起作用,RELA在其上的結(jié)合位點不起作用。在胃癌細胞AGS中免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),SIRT1與轉(zhuǎn)錄因子c-JUN能夠形成復(fù)合物。在慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的AGS細胞中進行免疫共沉淀實驗檢測SIRT1對c-JUN乙酰化水平的影響。發(fā)現(xiàn)SIRT1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中c-JUN乙酰化水平增加,而SIRT1過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中c-JUN乙酰化水平明顯降低。以上實驗證實SIRT1不僅與轉(zhuǎn)錄因子c-JUN間存在結(jié)合,還對c-JUN發(fā)揮了去乙酰化作用。在胃癌細胞AGS中的ChIP實驗結(jié)果表明:SIRT1被募集到轉(zhuǎn)錄因子c-JUN在ARHGAP5的啟動子的結(jié)合位點上。在SIRT1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞AGS及其對照細胞中進行ChIP實驗,qPCR實驗結(jié)果顯示:干擾SIRT1后SIRT1在ARHGAP5啟動子區(qū)的結(jié)合明顯減少,轉(zhuǎn)錄因子c-JUN在ARHGAP5啟動子區(qū)則大量聚集。以上結(jié)果證實,SIRT1被募集到ARHGAP5的啟動子上,與轉(zhuǎn)錄因子c-JUN結(jié)合,對其發(fā)揮了去乙酰化作用,從而抑制了轉(zhuǎn)錄因子c-JUN的轉(zhuǎn)錄活性以及ARHGAP5的表達。5.通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫中相關(guān)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),不同類型胃癌中ARHGAP5的表達高于正常的胃組織。在TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),胃癌中ARHGAP5的表達也明顯高于正常胃組織。來自NCBI GEO的數(shù)據(jù)(GSE63089和GSE13195)分析,我們發(fā)現(xiàn)ARHGAP5在胃癌中的表達明顯高于其癌旁組織。為了檢測ARHGAP5的表達水平,我們使用了石蠟包埋的含有90例胃癌患者癌組織和對應(yīng)癌旁組織的石蠟組織芯片進行免疫組化實驗。染色結(jié)果顯示在癌旁組織中ARHGAP5的表達明顯偏低,其中有四例患者的癌旁組織沒有著色。但是在癌組織中,ARHGAP5的表達是明顯增強的。以上對不同數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析及實驗結(jié)果統(tǒng)計證明,在胃癌組織中ARHGAP5的表達是明顯上調(diào)的。我們的實驗結(jié)果還顯示ARHGAP5的表達與腫瘤大小(p =0.003)、腫瘤浸潤程度(T期,p0.001)、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N期,p = 0.003)以及臨床分期(TNM分期,p＜ 0.001)等臨床病理特征有顯著相關(guān)性;我們使用單變量Cox回歸進行分析發(fā)現(xiàn):腫瘤大小(p = 0.003)、腫瘤浸潤程度(T期,p = 0.004)、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N期,p = 0.002)、臨床分期(TNM分期,p = 0.002)以及ARHGAP5的表達水平(p0.001)與病人的生存預(yù)后顯著相關(guān);此外,利用多因素Cox回歸分析進一步確認腫瘤浸潤程度(T期,p = 0.013)、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N期,p= 0.008)以及ARHGAP5的表達(p = 0.001)是胃癌病人生存預(yù)后的獨立預(yù)測因子;根據(jù)ARHGAP5的表達水平繪制患者生存曲線來比較患者的預(yù)后。高表達ARHGAP5的胃癌患者的生存狀況明顯差于低表達ARHGAP5的胃癌患者。對TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌病例信息進行生存分析,分析結(jié)果顯示腫瘤中高表達ARHGAP5的患者術(shù)后生存期較短;來自Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對胃癌患者的生存信息分析顯示,腫瘤中低表達ARHGAP5的胃癌患者擁有較長生存期。此外,在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中,當我們將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也納入總體生存分析中時,發(fā)現(xiàn)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中,ARHGAP5的表達水平對生存期的影響依然顯著,ARHGAP5的高水平表達對患者的預(yù)后是不利的。從以上數(shù)據(jù)分析可以看出,高表達的ARHGAP5與胃癌進展之間存在潛在聯(lián)系。6.利用ARHGAP5的特異小干擾轉(zhuǎn)染胃癌細胞AGS和BGC-823,利用qPCR技術(shù)及Western blot技術(shù)得到的結(jié)果顯示ARHGAP5的mRNA和蛋白表達水平顯著降低。用上述ARHGAP5干擾的胃癌細胞進行Transwell實驗(無/有基質(zhì)膠),結(jié)果表明胃癌細胞中ARHGAP5表達下調(diào)抑制了胃癌細胞的的遷移和侵襲。利用ARHGAP5的特異小干擾轉(zhuǎn)染SIRT1干擾的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞(AGS和BGC-823)及各自相應(yīng)對照細胞,Western blot技術(shù)再次驗證小干擾的有效性。Transwell實驗(無/有基質(zhì)膠)再次證實,ARHGAP5的下調(diào)抑制了胃癌細胞的遷移和侵襲,有力的回復(fù)了由于SIRT1表達降低誘導(dǎo)的胃癌細胞的遷移和侵襲。結(jié)論:SIRT1在體外可以抑制胃癌細胞的遷移和侵襲,在動物體內(nèi)同樣也可以抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。通過mRNA微陣列技術(shù)篩選出了 SIRT1下游靶基因——ARHGAP5。我們通過雙熒光素酶實驗、免疫共沉淀實驗和ChIP實驗證實:SIRT1能夠與轉(zhuǎn)錄因子c-JUN進行結(jié)合,并對其發(fā)揮去乙酰化作用。SIRT1被募集到了ARHGAP5的啟動子上,從而抑制了轉(zhuǎn)錄因子c-JUN的轉(zhuǎn)錄活性以及ARHGAP5的表達。數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析及組織芯片結(jié)果表明ARHGAP5在胃癌中的表達是明顯增強的;統(tǒng)計學(xué)分析顯示,ARHGAP5的表達與患者的腫瘤大小、腫瘤浸潤程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期等臨床病理特征有顯著相關(guān)性;Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),ARHGAP5的表達水平與胃癌病人的生存預(yù)后關(guān)系密切,ARHGAP5可以作為胃癌病人生存預(yù)后的一個獨立預(yù)測因子;另外來自數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析以及臨床標本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計得到的生存分析發(fā)現(xiàn),高表達的ARHGAP5對患者生存不利。不管是通過數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析還是所收集的臨床樣本結(jié)果都可以看出,高表達的ARHGAP5與胃癌進展之間存在潛在聯(lián)系。癌細胞功能實驗的驗證結(jié)果表明,在胃癌中下調(diào)基因ARHGAP5的表達抑制了胃癌細胞的遷移和侵襲。此外,在SIRT1干擾的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)及其對照的胃癌細胞中干擾ARHGAP5的表達,能夠顯著抑制胃癌細胞遷移和侵襲,并且能夠明顯的回復(fù)由于SIRT1表達降低誘導(dǎo)的胃癌細胞的遷移和侵襲。綜上所述,SIRT1通過轉(zhuǎn)錄因子c-JUN調(diào)控基因ARHGAP5表達的機制可能為今后胃癌的預(yù)防和治療提供新的靶點。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

毒ｓｈＲＮＡ及其對照，分別記作ＬＶ－Ｓｉ和ＬＶ－Ｃｉ。我們用劃痕實驗檢測胃癌細胞的逡逑遷移能力，在劃痕Ｏｈ、１６ｈ和２４ｈ時拍照記錄。結(jié)果顯示：過表達的ＳＩＲＴ１抑制逡逑了胃癌細胞的遷移，ＳＩＲＴ１干擾后促進了細胞的遷移（圖１、Ａ和Ｂ，圖２、Ａ逡逑和Ｂ）。ＳＩＲＴ１對胃癌細胞遷移的抑制作用也通過Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ實驗（無基質(zhì)膠）逡逑進行了驗證（圖１、Ｃ和Ｄ，圖２、Ｃ和Ｄ）。此外，我們還通過Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ實驗逡逑（有基質(zhì)膠）對胃癌細胞的侵襲能力進行了評估。發(fā)現(xiàn)：ＳＩＲＴ１過表達后胃癌細胞逡逑侵襲能力受到抑制，而ＳＩＲＴ１千擾后有利于胃癌細胞侵襲（圖１、Ｃ和Ｄ）。綜逡逑上所述，我們的結(jié)果表明ＳＩＲＴ１在體外對胃癌細胞的遷移和侵襲有抑制作用。逡逑４２逡逑

毒ｓｈＲＮＡ及其對照，分別記作ＬＶ－Ｓｉ和ＬＶ－Ｃｉ。我們用劃痕實驗檢測胃癌細胞的逡逑遷移能力，在劃痕Ｏｈ、１６ｈ和２４ｈ時拍照記錄。結(jié)果顯示：過表達的ＳＩＲＴ１抑制逡逑了胃癌細胞的遷移，ＳＩＲＴ１干擾后促進了細胞的遷移（圖１、Ａ和Ｂ，圖２、Ａ逡逑和Ｂ）。ＳＩＲＴ１對胃癌細胞遷移的抑制作用也通過Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ實驗（無基質(zhì)膠）逡逑進行了驗證（圖１、Ｃ和Ｄ，圖２、Ｃ和Ｄ）。此外，我們還通過Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ實驗逡逑（有基質(zhì)膠）對胃癌細胞的侵襲能力進行了評估。發(fā)現(xiàn)：ＳＩＲＴ１過表達后胃癌細胞逡逑侵襲能力受到抑制，而ＳＩＲＴ１千擾后有利于胃癌細胞侵襲（圖１、Ｃ和Ｄ）。綜逡逑上所述，我們的結(jié)果表明ＳＩＲＴ１在體外對胃癌細胞的遷移和侵襲有抑制作用。逡逑４２逡逑

細胞（５＞＜１0３個／只）被尾靜脈注入免疫缺陷的裸鼠體內(nèi)。４周后，處死小鼠，取逡逑月市，拍照，稱重，４％甲醛固定，ＨＥ染色，用于轉(zhuǎn)移檢查。注射ＳＩＲＴ１過表達胃逡逑癌細胞組的小鼠肺的外觀大小及重量比對照組小得多（圖３、Ａ和Ｂ）。通過組逡逑織切片染色后發(fā)現(xiàn)，注射ＳＩＲＴ】過表達細胞組的裸鼠肺中出現(xiàn)較少轉(zhuǎn)移（圖３、逡逑Ｃ）。與此相反，注射ＳＩＲＴ１干擾細胞組的小鼠肺明顯比對照組大且重（圖３、逡逑Ａ和Ｂ），而且在裸鼠肺內(nèi)出現(xiàn)了較對照組更多的轉(zhuǎn)移灶（圖３、Ｃ）。因此，逡逑上述數(shù)據(jù)提示Ｓ１ＲＴＩ可以抑制體內(nèi)胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。逡逑Ａ邐Ｂ邋Ｎｏｒｍａ｜邋ＬＶ－Ｃ邋ＬＶ－Ｓ邋ＬＶ－Ｃｉ邋ＬＶ－Ｓｉ－１邋ＬＶ－Ｓｉ－２逡逑°邋Ｎｏｒｍａｌ邋ＬＶ邋Ｃ邋ＬＶ邋Ｓ邋ＬＶ＊．Ｃｉ邋ＬＶ．Ｓｉ．，ＬＶ．ｂ．２逡逑ｎ逡逑ｗ邋Ｎｏｒｍａｌ邐ＬＶ－Ｃ邐ＬＶ－Ｓ邐ＬＶ－Ｃｉ邐ＬＶ＾ｉ－１邐ＬＶ－Ｓｉ－２逡逑l#盡媝＿逡逑圖３、ＳＩＲＴｌ抑制胃癌在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。將慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的ＢＧＣ－８２３細胞（５ｘｌ0３個／逡逑只）通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)。四周后，小鼠處死，不做任何處理的裸鼠看作逡逑是正常。（Ａ）裸鼠取肺并稱重評估。數(shù)據(jù)表示形式為：平均值±標準差。有統(tǒng)逡逑汁學(xué)意義的結(jié)果用＊標注，＊＊＊代表ｐ＜０．００ｌ。（Ｂ）各組肺的代表性圖片。（Ｃ）逡逑有轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的肺蘇木素－伊紅染色。放大倍數(shù)：上面一組放大倍數(shù)＞＜４０倍，下面逡逑一組放大倍數(shù)ＸＩ００倍。逡逑３．

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本文編號：2749771