【摘要】：目的:子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年來(lái)隨著人口老齡化、人口增長(zhǎng)、人口體重增加,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年增加。全球每年大約有320,000名女性被診斷為子宮內(nèi)膜癌。盡管子宮內(nèi)膜癌以I期最為常見,并且采用手術(shù)治療后5年生存率可達(dá)到85-90%,但對(duì)于III IV期的女性患者即使規(guī)范化的手術(shù)、放療及化療聯(lián)合治療后,其5年生存率僅為30-40%。聯(lián)合化療可以提高晚期及復(fù)發(fā)患者的無(wú)瘤生存期,但并不提高其總生存時(shí)間。美國(guó)最近的調(diào)查表明其子宮內(nèi)膜癌五年生存率大約81.8%,每年有近4489名II IV期子宮內(nèi)膜癌患者死亡,而在發(fā)展中國(guó)家僅僅為67%。因此新型抗腫瘤藥物有待探究。NK-1受體即神經(jīng)激肽-1受體,是鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一,廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官,包括紋狀體、腦干、脊髓、胃腸道、膀胱、甲狀腺、各種免疫細(xì)胞、肺氣道上皮和粘膜下腺細(xì)胞,在疼痛、偏頭痛、炎癥、情緒調(diào)控、焦慮、藥物濫用、惡心、嘔吐等多種生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。近幾十年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)NK-1受體參與多種腫瘤的增生、轉(zhuǎn)移和新血管生成過程。NK-1受體拮抗劑通過與其受體結(jié)合發(fā)揮抗腫瘤作用。L-733060是一個(gè)高選擇、高效、長(zhǎng)效的非肽類NK-1受體拮抗劑,其在多種腫瘤細(xì)胞中具有抗腫瘤作用,但對(duì)子宮內(nèi)膜癌的作用尚沒有相關(guān)報(bào)道。本研究以Ishikawa細(xì)胞系為研究對(duì)象,采用MTT法、流式細(xì)胞儀、Transwell觀察其對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和侵襲力的影響,探索子宮內(nèi)膜癌新的治療方法。方法:1 Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng):Ishikawa細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)提供,培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)50%-60%。2 MTT法檢測(cè)L-733060對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖影響:將Ishikawa細(xì)胞分為對(duì)照組及含不同濃度L-733060(5、10、20、40μM)的實(shí)驗(yàn)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的Ishikawa細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,將5x10~4個(gè)Ishikawa細(xì)胞按分組接種于96孔板,作用48h之后,加入MTT,通過酶標(biāo)儀觀察吸光度,計(jì)算抑制率,進(jìn)而判斷L-733060對(duì)Ishikawa細(xì)胞的作用效果及最佳作用濃度。3流式細(xì)胞儀檢測(cè)L-733060對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期及凋亡的影響:將Ishikawa細(xì)胞分為對(duì)照組及含不同濃度L-733060(5、10、20、40μM)的實(shí)驗(yàn)組。藥物處理48h。(1)凋亡:經(jīng)5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色后,通過流式細(xì)胞儀分析L-733060對(duì)Ishikawa細(xì)胞凋亡的影響。(2)周期:用預(yù)冷70%乙醇4℃固定12h。Binding Buffer重懸細(xì)胞。PI染色后通過流式分析L-733060對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期的影響。4 Transwell小室法檢測(cè)L-733060對(duì)Ishikawa細(xì)胞侵襲能力的影響:將Ishikawa細(xì)胞分為對(duì)照組及含不同濃度L-733060(5、10、20、40μM)的實(shí)驗(yàn)組。按分組將經(jīng)過饑餓處理的Ishikawa細(xì)胞接種于Transwell小室(24孔板,8μm孔徑,人工基底膜基質(zhì)1mg/m L)的上室,藥物處理48h之后,通過計(jì)算透膜細(xì)胞數(shù)評(píng)價(jià)L-733060對(duì)Ishikawa細(xì)胞侵襲的影響。5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理:數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析,采用Levene分析進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。組間差異采用LSD進(jìn)行兩兩比較。α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),認(rèn)為P0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖的描繪采用Graph Pad Prism 5以及SPSS13.0軟件。結(jié)果:1應(yīng)用不同濃度L-733060(5、10、20、40μM)作用48h后MTT測(cè)定結(jié)果:抑制率分別是10.260±2.746%、22.633±3.050%、61.180±5.346%、91.873±8.905%。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在5至40μM濃度范圍內(nèi)L-733060能夠抑制Ishikawa細(xì)胞系的生長(zhǎng),并且伴隨著濃度增高這種抑制作用逐漸增強(qiáng)。2不同濃度L-733060(0、5、10、20、40μM)作用48h后流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果:各組凋亡百分率分別為4.437%±0.952%、7.767%±1.725%、11.82%±1.350%、19.723%±1.957%、26.39%±2.168%。各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),且L-733060濃度越高,凋亡百分率越高。3不同濃度L-733060(0、5、10、20、40μM)作用48h后測(cè)量G0-G1期細(xì)胞百分比分別為45.390±0.948%、47.253±1.546%、54.287±1.826%、63.730±1.721%、69.293±1.895%。G2-M期細(xì)胞百分比分別為16.323±0.441%、15.593±0.402%、13.160±0.881%、10.637±0.497%、8.183±1.204%。S期細(xì)胞百分比分別為38.967±1.670%、37.203±1.491%、32.400±1.213%、25.633±1.245%、22.523±0.725%。L-733060可增加G0-G1期細(xì)胞分布,減少S期和G2-M期細(xì)胞分布,且隨著濃度的增加,G0-G1期細(xì)胞比例明顯增加,S期和G2-M期細(xì)胞比例明顯減少,各細(xì)胞周期的分布比例具有明顯差異(P0.01)。4不同濃度L-733060(0、5、10、20、40μM)作用48h后穿膜細(xì)胞數(shù)分別為177.333±30.989、152.000±27.875%、94.333%±19.604%、51.000±12.000、10.333±4.163。L-733060作用后穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1 L-733060能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖,且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),濃度與抑制程度呈線性正相關(guān)。表明了NK-1受體拮抗劑可以抑制子宮內(nèi)膜癌的增殖,為子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的依據(jù)。2 L-733060可以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡,且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),細(xì)胞凋亡百分比與藥物濃度呈線性正相關(guān)。從細(xì)胞周期角度觀察,L-733060可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞進(jìn)入S期,使細(xì)胞停留G0-G1期,抑制細(xì)胞分裂,從而引起細(xì)胞凋亡。證明了NK-1受體拮抗劑可以通過誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,其抗腫瘤作用可能與改變腫瘤細(xì)胞周期有關(guān)。3 L-733060能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲,藥物濃度越大,細(xì)胞侵襲能力越低。表明了NK-1受體拮抗劑可能成為抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物。從而為子宮內(nèi)膜癌尤其是晚期的子宮內(nèi)膜癌的治療提供了新的方法。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
【圖文】：

MTT法測(cè)量不同濃度L-733060對(duì)Ishikawa細(xì)胞抑制率的影響

TT 法測(cè)量不同濃度 L-733060 對(duì) Ishikawa 細(xì)胞抑制 MTT assay to measure the effects of L-733,060 on Ishproliferation.

式細(xì)胞儀測(cè)量不同濃度 L-733060 對(duì) Ishikawa 細(xì)胞周low cytometry to measure the effects of L-733,060 on c

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2746193