【摘要】：研究背景腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是一種起源于腦膠質(zhì)細胞的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤,根據(jù)美國腦腫瘤注冊中心(CBTRUS)最新統(tǒng)計結(jié)果,膠質(zhì)瘤占腦腫瘤總數(shù)的28%及顱內(nèi)惡性腫瘤的80%。在我國,雖尚無大規(guī)模流行病調(diào)查資料,但綜合多篇臨床資料統(tǒng)計,國內(nèi)膠質(zhì)瘤發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的40%-67%,膠質(zhì)瘤已成為危害人民群眾生命健康的主要顱腦疾病。盡管手術(shù)及放化療等多種治療手段的聯(lián)合應用,其預后仍極差。以多形性膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)為例,患者的平均生存期僅為14.6個月。放射治療聯(lián)合替莫唑胺(Temozolomide, TMZ)化療作為手術(shù)切除膠質(zhì)瘤后重要的輔助治療手段,對延長患者的生存期有一定的作用。然而綜合治療后膠質(zhì)瘤最終會復發(fā),復發(fā)部位往往臨近手術(shù)切除區(qū)域。由于膠質(zhì)瘤廣泛浸潤到周圍腦組織,這些復發(fā)一方面是由于膠質(zhì)瘤細胞自身可以產(chǎn)生并釋放一系列的抑制性因子如IL-10、TGF-β、PGE2等從而參與了膠質(zhì)瘤的免疫逃逸,另一方面腫瘤細胞與周圍基質(zhì)細胞(Stromal Cell)的相互作用也可能是誘導膠質(zhì)瘤復發(fā)的重要因素。因此,對膠質(zhì)瘤周圍基質(zhì)細胞進行研究,分析基質(zhì)細胞在膠質(zhì)瘤治療以及復發(fā)時與腫瘤細胞的作用機制,將有助于提高膠質(zhì)瘤的治療效果,抑制腫瘤復發(fā)。膠質(zhì)瘤周圍基質(zhì)細胞包括膠質(zhì)細胞,內(nèi)皮細胞,免疫細胞及神經(jīng)元細胞等多種細胞,其中膠質(zhì)細胞分布最廣,所占比例最大。星形膠質(zhì)細胞(Astrocyte)作為膠質(zhì)細胞的主要組成部分,已經(jīng)被證實在黑色素瘤和乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移瘤中上調(diào)腫瘤細胞的生存基因,并提高腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。但對于腦膠質(zhì)瘤,尚無研究表明星形膠質(zhì)細胞發(fā)揮著同樣的促腫瘤生長及耐藥的作用。為進一步研究星形膠質(zhì)細胞的作用,需要建立合理的體外及動物模型。模型除了能夠盡可能的模擬膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程外,還應該能夠高效快速的將星形膠質(zhì)細胞與腫瘤細胞分選開來,進而對星形膠質(zhì)細胞對膠質(zhì)瘤生長的影響做進一步的機制研究。體外模型是指在生物體外采用細胞或者生物分子來模擬生物體內(nèi)的生理或病理活動進而對其進行研究所建立的模型。為研究基質(zhì)細胞耐藥性作用而建立體外模型的基本思路是將基質(zhì)細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng),加入抗腫瘤藥物后,對比腫瘤細胞單獨培養(yǎng)時腫瘤細胞的生存率,進而得出基質(zhì)細胞對腫瘤細胞增殖的影響。共培養(yǎng)后,可以在不分離出基質(zhì)細胞的情況下,檢測腫瘤細胞的生存率,也可以將基質(zhì)細胞從共培養(yǎng)模型中分離出來,分析哪些信號通路或細胞因子的表達有所變化,尋找可能影響腫瘤生存率或抗藥性的靶點。目前,已有建立的二維(2-Dimensional,2-D)單層腫瘤細胞與基質(zhì)細胞的共培養(yǎng)模型。但實體性腫瘤如膠質(zhì)瘤在體內(nèi)并不是單層生長,而是呈團塊樣三維(3-Dimensional,3-D)生長,2-D模型并不能很好的模擬實體性腫瘤的生長方式。動物實驗作為連接基礎研究與臨床治療之間的橋梁,發(fā)揮著極為重要的作用。免疫缺陷裸鼠因其可成功的進行異體移植生成腫瘤而被廣泛的應用于腫瘤研究,膠質(zhì)瘤細胞系或來源于患者術(shù)后的膠質(zhì)瘤原代組織都可以在裸鼠顱內(nèi)原位種植并形成腫瘤。在近十年中,多種表達熒光的免疫缺陷小鼠品系被培育出來,并被證實可成功的進行多種腫瘤包括膠質(zhì)瘤的異體移植及細胞分離,這對于研究基質(zhì)細胞對腫瘤生長、侵襲及耐藥的作用具有重要意義。免疫缺陷裸大鼠除了具有免疫缺陷小鼠的特點外,還具有生命周期長,體積大、便于手術(shù)操作,以及能提供更多的腫瘤組織進行實驗研究等特點,但目前尚無熒光免疫缺陷裸大鼠構(gòu)建成功的報道。本課題包括兩部分,第一部分：構(gòu)建膠質(zhì)瘤細胞與星形膠質(zhì)細胞體外三維共培養(yǎng)模型,并通過螢火蟲熒光素檢測技術(shù),對三維共培養(yǎng)模型中的膠質(zhì)瘤細胞活性進行定量檢測,分析星形膠質(zhì)細胞在膠質(zhì)瘤化療耐受中的作用及機制；第二部分：構(gòu)建綠色熒光免疫缺陷裸大鼠動物模型,該模型進行膠質(zhì)瘤的異體移植后可載瘤生存,并可對腫瘤組織中的膠質(zhì)瘤細胞和基質(zhì)細胞進行高效分離。期望通過以上兩種模型的建立,能為膠質(zhì)瘤中基質(zhì)細胞與腫瘤細胞交互作用的研究提供新的方法和思路。一.構(gòu)建腦膠質(zhì)瘤三維共培養(yǎng)模型研究基質(zhì)細胞介導的化療抵抗目的構(gòu)建eGFP-Luc膠質(zhì)瘤細胞與星形膠質(zhì)細胞三維共培養(yǎng)體外模型,通過Luciferin熒光檢測技術(shù),對三維共培養(yǎng)模型中的膠質(zhì)瘤細胞活性進行定量檢測,分析星形膠質(zhì)細胞在膠質(zhì)瘤化療耐受中的作用及機制。方法1.制作綠色熒光和生物熒光素的慢病毒并轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系用包裝質(zhì)粒psPAX.2,包膜質(zhì)粒pMD2.G和載體質(zhì)粒eGFP/Luciferase通過BBS/CaCl2方法轉(zhuǎn)染293FT細胞,轉(zhuǎn)染成功后48小時收集病毒。病毒轉(zhuǎn)染HF66,A172,LN18,U251,C6膠質(zhì)瘤細胞系及P3膠質(zhì)瘤原代細胞系。轉(zhuǎn)染成功后,利用流式細胞儀根據(jù)增強綠色熒光蛋白(eGFP)的表達分選出表達eGFP和螢火蟲熒光素酶(Luciferase)的細胞,進行培養(yǎng)。2.構(gòu)建腦膠質(zhì)瘤和星形膠質(zhì)細胞的三維共培養(yǎng)模型選擇96孔V型板,每孔中加入8000個eGFP/Luc膠質(zhì)瘤細胞和5000個TNC-1星形膠質(zhì)細胞,按照1.74μg/mL的濃度加入甲基纖維素(Methylcellulose),用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)每孔100μl,室溫下756G轉(zhuǎn)速離心15分鐘,使細胞沉聚于V型板底部。培養(yǎng)48小時,熒光顯微鏡下觀察三維共培養(yǎng)團塊形成。3.生物熒光素法檢測三維共培養(yǎng)模型中膠質(zhì)瘤細胞的增殖①檢測生物熒光強度與膠質(zhì)瘤細胞數(shù)目的關系。在96孔板中分別種植不同數(shù)目的U251和A172膠質(zhì)瘤細胞,培養(yǎng)48小時形成三維腫瘤團塊。加入D-Luciferin,避光培育30分鐘,檢測三維腫瘤團塊的生物熒光強度。②星形膠質(zhì)細胞的數(shù)目是否影響三維共培養(yǎng)模型的生物熒光強度。8000/孔的A172膠質(zhì)瘤細胞分別與不同數(shù)目的TNC-1細胞共培養(yǎng)48小時,加入D-Luciferin,避光培育30分鐘,檢測不同TNC-1數(shù)目三維共培養(yǎng)團塊的生物熒光強度。③加入化療藥物后,生物熒光素法檢測三維共培養(yǎng)模型的生物熒光強度。膠質(zhì)瘤細胞與TNC-1形成三維共培養(yǎng)團塊后,分別加入TMZ和阿霉素(Doxurubicin)進行培養(yǎng)。5天后,生物熒光素法檢測三維共培養(yǎng)模型的生物熒光強度。4.比較生物熒光素法與MT8法檢測三維共培養(yǎng)模型中膠質(zhì)瘤細胞增殖的準確性①按每孔8000細胞將LN18膠質(zhì)瘤細胞分別種入兩個96孔板,培育2天形成三維腫瘤團塊后,加入不同濃度的TMZ。培育5天,分別進行MTS法和生物熒光素檢測。檢測后收集不同濃度組的腫瘤團塊,加入酶消化成單細胞懸液后流式細胞儀計數(shù)LN18膠質(zhì)瘤細胞。②按每孔8000 LN18細胞和5000 TNC-1細胞,種入兩個96孔板,培育2天形成腫瘤團塊后,加入不同濃度的TMZ。培育5天,分別進行MTS法和生物熒光素法檢測。檢測后收集不同濃度組的腫瘤團塊,加入酶消化成單細胞懸液后流式細胞儀計數(shù)表達eGFP的LN18細胞數(shù)目。③分別用MTS法和生物熒光素檢測法檢測U251、A172、C6膠質(zhì)瘤細胞與TNC-1細胞三維共培養(yǎng)團塊中膠質(zhì)瘤細胞的增殖。5.檢測星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的抵抗膠質(zhì)瘤細胞單獨或與TNC-1共培養(yǎng)2天,分別形成三維腫瘤團塊和三維共培養(yǎng)團塊。加入不同濃度的TMZ或阿霉素,培養(yǎng)5天后,生物熒光素法檢測三維團塊的生物熒光強度。結(jié)果1.制作攜帶增強綠色熒光和生物熒光素基因的慢病毒并轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系同時具有eGFP和Luciferase基因的慢病毒轉(zhuǎn)染不同的膠質(zhì)瘤細胞系及膠質(zhì)瘤原代細胞系P3。轉(zhuǎn)染后免疫熒光顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細胞表達綠色熒光,確認轉(zhuǎn)染成功后,流式細胞技術(shù)分選出高表達綠色熒光的膠質(zhì)瘤細胞,進行培養(yǎng)。2.構(gòu)建腦膠質(zhì)瘤和星形膠質(zhì)細胞的三維共培養(yǎng)模型熒光顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細胞與TNC-1細胞形成的三維共培養(yǎng)模型呈球狀,綠色熒光分布均一,模擬了膠質(zhì)瘤在體內(nèi)呈三維生長的生物學特性。3.生物熒光素法檢測三維共培養(yǎng)模型中膠質(zhì)瘤細胞的增殖三維共培養(yǎng)模型中,生物熒光素強度與膠質(zhì)瘤細胞的數(shù)目呈正比,基質(zhì)細胞TNC-1的數(shù)目不影響熒光強度。加入化療藥物替莫唑胺和阿霉素培育后,仍可加入D-luciferin進行生物熒光檢測,對檢測結(jié)果無影響。4.檢測三維共培養(yǎng)模型中膠質(zhì)瘤細胞的增殖,生物熒光素法較MTS法更準確生物熒光素法和MTS法的檢測數(shù)值分別與流式細胞術(shù)計數(shù)結(jié)果相比較,生物熒光素法較MTS法更加靈敏和準確,更能反映三維共培養(yǎng)模型中膠質(zhì)瘤細胞的增殖情況。5.對于不同的膠質(zhì)瘤細胞,星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞化療抵抗的作用不同TNC-1能增強J251、C6、A172和P3對TMZ的耐受性,促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖,對LN18和HF66無影響。TNC-1能增強U251、LN18和HF66對阿霉素的耐受性,促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖；隨阿霉素濃度的增加,能降低A172對阿霉素的耐受性,抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖；對C6、P3無影響。結(jié)論1.生物熒光素法檢測三維共培養(yǎng)模型的生物熒光強度與膠質(zhì)瘤細胞數(shù)目成正比。2.三維共培養(yǎng)模型中基質(zhì)細胞的數(shù)目對生物熒光強度的檢測無影響。3.三維共培養(yǎng)模型中檢測膠質(zhì)瘤細胞的增殖,生物熒光素法較MTS法更為準確和靈敏。4.TNC-1能增強U251、C6、A172和P3對TMZ的耐受性,對LN18和HF66無影響。5.TNC-1能增強U251、LN18和HF66對阿霉素的耐受性,降低A172對阿霉素的耐受性,對C6、P3無影響。二.構(gòu)建綠色熒光裸大鼠模型研究腫瘤與基質(zhì)反應目的構(gòu)建綠色熒光裸大鼠作為研究腫瘤與基質(zhì)反應的動物模型,驗證綠色熒光裸大鼠可進行腫瘤細胞或組織的異體移植形成腫瘤,并可對腫瘤組織中的腫瘤細胞和基質(zhì)細胞進行高效分選。方法1.培育能表達綠色熒光的免疫缺陷裸大鼠①表達綠色熒光的SD-TG(GFP)2BalRrrc轉(zhuǎn)基因鼠和HsdHanTM:mu/mu Rowett裸大鼠進行繁殖。子代用PCR進行基因表型檢測,雜合的GFP鼠與上一代的HsdHanTM:mu/mu Rowett繼續(xù)繁殖,獲得雜合的表達綠色熒光的裸大鼠。②手術(shù)取得綠色熒光裸大鼠的新鮮腦、心臟、腎、肺、肝臟、小腸等器官,紫外線解剖顯微鏡下觀察器官是否表達綠色熒光。RT-PCR定量各器官中綠色熒光蛋白mRNA的表達量。2.比較綠色熒光裸大鼠與和免疫缺陷裸大鼠的免疫表型抽取用于繁殖的兩種大鼠以及綠色熒光裸大鼠的外周血,用不同的免疫熒光抗體(CD3, CD19, CD161)結(jié)合免疫細胞,流式細胞術(shù)檢測不同的血液標本中T、B及NK細胞的存在情況。3.驗證綠色熒光裸大鼠能否進行腫瘤細胞異體移植①注射表達紅色熒光的鼠乳腺癌細胞系dsRed4T1于綠色熒光裸大鼠的乳腺,觀察是否有腫瘤形成。②取6位膠質(zhì)瘤患者的原代腫瘤組織,立體定向種植于綠色熒光裸大鼠的顱內(nèi),磁共振掃描觀察是否有腫瘤形成。處死大鼠取得腦組織,制作腦組織蠟塊,切片后進行HE染色,確認腫瘤的邊界。4.分離綠色熒光裸大鼠腫瘤組織中的腫瘤細胞和基質(zhì)細胞①手術(shù)取得綠色熒光裸大鼠的乳腺癌組織,機械切碎后酶解為單細胞懸液。流式細胞儀分選表達紅色熒光的乳腺癌細胞和綠色熒光的基質(zhì)細胞。②手術(shù)取得綠色熒光裸大鼠的膠質(zhì)瘤組織,機械切碎后酶解為單細胞懸液。流式細胞儀分選表達綠色熒光的基質(zhì)細胞和不表達綠色熒光的腫瘤細胞。用人細胞核(HuNu)特異性抗體對分選前后的細胞進行免疫細胞化學(ICC)染色,確認分選效率。結(jié)果1.構(gòu)建能表達綠色熒光的裸大鼠模型表達綠色熒光的SD-TG(GFP)2BalRrrc轉(zhuǎn)基因鼠和HsdHanTM:rnu/rnu Rowett裸大鼠進行繁殖,得到表達綠色熒光的裸大鼠。裸大鼠的腦、心臟、腎、肺、肝臟、小腸的均表達綠色熒光,RT-PCR表明腦組織表達量最高,心臟表達量最低。2.綠色熒光裸大鼠與免疫缺陷裸大鼠具有相同的免疫表型流式細胞術(shù)分析大鼠外周血,綠色熒光裸大鼠和HsdHanTM:rnu/rnu Rowett裸大鼠都缺少T淋巴細胞,但都具有B淋巴細胞和NK細胞。3.綠色熒光裸大鼠可以進行腫瘤細胞的異體移植表達紅色熒光的鼠乳腺癌細胞系dsRed4T1原位移植后形成乳腺癌；MRI檢測以及取得標本后的HE染色證實6組來源于不同膠質(zhì)瘤患者的腫瘤原代細胞有5組在綠色熒光裸大鼠顱內(nèi)形成腫瘤。4.綠色熒光裸大鼠腫瘤組織中的腫瘤細胞和基質(zhì)細胞可進行高效分離流式細胞術(shù)可以高效分選表達紅色熒光的4T1乳腺癌細胞、不表達熒光的膠質(zhì)瘤細胞和表達綠色熒光的基質(zhì)細胞。結(jié)論1.綠色熒光裸大鼠各器官穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白。2.綠色熒光蛋白在腦組織中表達最高,心臟中表達最低。3.綠色熒光裸大鼠與免疫缺陷裸大鼠免疫表型相同,不表達T淋巴細胞。4.鼠乳腺癌細胞和人腦膠質(zhì)瘤原代組織可在綠色熒光裸大鼠上進行異體原位移植。5.流式細胞術(shù)可高效分選綠色熒光裸大鼠腫瘤組織中的腫瘤細胞和基質(zhì)細胞。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張磊;王效民;;基質(zhì)細胞與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關系[J];中國癌癥雜志;2009年10期

2 于洪臣，張紅梅，凌翎，于志強，劉及;小鼠脾基質(zhì)細胞特性與功能研究[J];中華放射醫(yī)學與防護雜志;1996年01期

3 王焱,胡群,佟立;關于“基質(zhì)”概念的研究進展及應用[J];內(nèi)蒙古民族大學學報(自然科學版);2002年05期

4 陳希平,陳希哲,林云鋒,田衛(wèi)東,唐尤超,李聲偉;人體脂肪基質(zhì)細胞成肌潛能研究[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2004年06期

5 付勁蓉;陳惠芹;張緒超;黃紹良;周敦華;黃科;;人胚胎造血的AGM區(qū)基質(zhì)細胞基因表達譜分析[J];中國實驗血液學雜志;2006年04期

6 周永勝;劉云松;周書敏;譚建國;;人脂肪基質(zhì)細胞的分離、培養(yǎng)、增殖及傳代穩(wěn)定性[J];口腔頜面修復學雜志;2006年03期

7 陳連鳳;林雪;方全;;大鼠脂肪基質(zhì)細胞分離培養(yǎng)探討[J];中國比較醫(yī)學雜志;2007年12期

8 鄭長玉;小鼠骨髓細胞長期培養(yǎng)中支持造血的基質(zhì)細胞輻射抗性[J];國外醫(yī)學(放射醫(yī)學分冊);1986年03期

9 杜心W

本文編號：2746265