【摘要】：乳腺癌是女性癌癥患者中患病比例最高的異質性惡性腫瘤,目前乳腺癌治療中面臨的主要困難是乳腺癌轉移以及腫瘤耐藥性,因此研究新型抗腫瘤轉移敏感性藥物將具有重要的臨床意義。開發(fā)已上市藥物的抗癌轉移功能及其分子機制是最為快速有效的方式。環(huán)孢素A(Cyclosporine A,CsA)是一種臨床中常用的免疫抑制劑,常用于器官移植后的抗排斥治療。近年來的研究發(fā)現(xiàn),環(huán)孢素A具有抑制乳腺癌細胞增殖和轉移的功能,但也有統(tǒng)計分析結果顯示使用環(huán)孢素A人群中乳腺癌發(fā)病率低于普通人群,因此進一步研究環(huán)孢素A在乳腺癌轉移中的作用及機制有助于拓展環(huán)孢素A的應用。環(huán)孢素A通過與細胞內的肽酰脯氨酰異構酶蛋白家族,即親環(huán)素蛋白家族(Peptidylprolyl isomerase,或cyclophilin)發(fā)揮免疫抑制功能。近期的組學分析發(fā)現(xiàn),親環(huán)素蛋白家族成員親環(huán)素類似蛋白2(Peptidylprolyl isomerase(cyclophilin)-like 2,PPIL2,即Cyp60、CYP4)調節(jié)肌動蛋白細絲F-actin的分布,并且是腫瘤轉移相關小RNAmiR-31的下游靶基因,說明PPIL2可能與癌癥轉移有關。本文旨在研究PPIL2在乳腺癌轉移中的功能及可能性,以理解和探索環(huán)孢素A應用于乳腺癌治療的可能性。本文主要研究內容如下:(1)以人類乳腺癌細胞系MCF-7、T47D和ZR-75-30以及人類乳腺細胞MCF-10A為實驗材料,通過相差顯微鏡成像、免疫印跡和免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),PPIL2表達水平與乳腺癌細胞的形態(tài)和F-actin分布存在相關性;通過細胞劃痕、Transwell侵襲小室、免疫印跡、免疫熒光和小鼠乳腺癌肺轉移模型實驗表明,PPIL2抑制乳腺癌細胞侵襲與轉移。(2)通過免疫印跡、RT-PCR和報告基因實驗發(fā)現(xiàn)PPIL2調節(jié)上皮細胞-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程相關的分子標志物蛋白的表達水平,并通過下調EMT調節(jié)因子SNAI1蛋白水平,減少其在E-cadherin啟動子上的結合,從而確定PPIL2負調控EMT過程。(3)以人類乳腺癌細胞系MCF-7和ZR-75-30為實驗材料,利用免疫共沉淀、哺乳動物雙雜交證明細胞內PPIL2結合SNAI1,利用GST-pulldown實驗表明PPIL2和SNAI1存在直接相互作用;通過構建PPIL2和SNAI1截短體表達質粒進行免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)PPIL2的U-box結構域介導其與SNAI1的結合,SNAI1的氮末端介導其與PPIL2的結合。通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),PPIL2和SNAII共定位在乳腺癌細胞核內。(4)以人類乳腺癌細胞系MCF-7和ZR-75-30為實驗材料,通過免疫印跡、免疫共沉淀和核質分離實驗發(fā)現(xiàn)PPIL2通過促進細胞核內SNAI1的K48類型泛素化,降低其蛋白穩(wěn)定性,減少細胞內SNAI1蛋白水平。(5)以人類乳腺癌細胞系ZR-75-30為實驗材料,通過免疫印跡、免疫共沉淀、免疫熒光、細胞劃痕、Transwell侵襲小室和小鼠乳腺癌肺轉移模型實驗發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A通過PPIL2抑制乳腺癌細胞的侵襲與轉移。(6)以人乳腺癌組織樣本為實驗材料,通過免疫組織化學方法分析PPIL2與SNAI1在乳腺癌組織中的表達及意義,發(fā)現(xiàn)PPIL2與SNAI1在乳腺癌組織中的表達呈顯著負相關性,并且PPIL2和SNAI1表達水平與乳腺癌組織的浸潤和轉移狀態(tài)具有顯著相關性。綜上所述,本論文揭示了 PPIL2通過影響F-actin分布和促進SNAI1泛素化降解調控EMT及乳腺癌轉移的分子機制,并且環(huán)孢素A抑制乳腺癌轉移依賴PPIL2進行。該結果有助于進一步理解環(huán)孢素A和親環(huán)素蛋白在乳腺癌中的功能,”為將環(huán)孢素A開發(fā)為新型抗癌藥物提供新的思考方向。
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

［２１］。雖然目前調節(jié)三種ＥＭＴ的具體信號尚不完全清楚，但人們普遍認同這三種ＥＭＴ過逡逑程具有顯著的功能差異（圖１．３）。逡逑１型ＥＭＴ主要發(fā)生在胚胎植入、胚胎發(fā)生和器官發(fā)育過程中。在胚胎發(fā)生和器官發(fā)逡逑育的早期階段，細胞在生長和分化過程中將經歷幾輪ＥＭＴ和間充質細胞－上皮轉化逡逑（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｔｒａｎｓｉｔｏｎ，邋ＭＥＴ）交替變化。囊胚是在發(fā)育初期形成的結構，逡逑由外層的滋養(yǎng)細胞層，圍繞內層的細胞團和充滿液體的囊胚腔組成。在滋養(yǎng)細胞層逡逑ＥＭＴ被激活，促進細胞侵入子宮內膜，激活胎盤功能。在囊胚內，ＥＭＴ誘導內層細胞逡逑團進入并沿著未來的中線遷移形成外胚層，中胚層和內胚層，其中每層將逐步分化為逡逑身體結構。ＥＭＴ也參與胚胎發(fā)育的后期，包括心臟瓣膜，骨骼肌和腭的形成。發(fā)育完逡逑－４－逡逑

邐Ｖｉｍｅｎｔｉｎ逡逑Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邐＾＾逡逑圖１．２邋ＥＭＴ過程中細胞形態(tài)變化逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｉｎ邋ＥＭＴ逡逑１．２．２邋ＥＭＴ的類型逡逑在２００７年波蘭ＥＭＴ會議和２００８年３月在冷泉港實驗室舉行的會議上，根據(jù)ＥＭＴ發(fā)生逡逑的生物學過程及其導致的功能后果，討論了將ＥＭＴ分類為三種不同生物學亞型的建議逡逑［２１］。雖然目前調節(jié)三種ＥＭＴ的具體信號尚不完全清楚，但人們普遍認同這三種ＥＭＴ過逡逑程具有顯著的功能差異（圖１．３）。逡逑１型ＥＭＴ主要發(fā)生在胚胎植入、胚胎發(fā)生和器官發(fā)育過程中。在胚胎發(fā)生和器官發(fā)逡逑育的早期階段，細胞在生長和分化過程中將經歷幾輪ＥＭＴ和間充質細胞－上皮轉化逡逑（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｔｒａｎｓｉｔｏｎ，邋ＭＥＴ）交替變化。囊胚是在發(fā)育初期形成的結構，逡逑由外層的滋養(yǎng)細胞層，圍繞內層的細胞團和充滿液體的囊胚腔組成。在滋養(yǎng)細胞層逡逑ＥＭＴ被激活，促進細胞侵入子宮內膜，激活胎盤功能。在囊胚內，ＥＭＴ誘導內層細胞逡逑團進入并沿著未來的中線遷移形成外胚層

親環(huán)素類似蛋白２調控乳腺癌轉移的分子機制蛋白質穩(wěn)定性。Ｓ１０４和Ｓ１０７位點的磷酸化可促進了ＳＮＡＩ１蛋白出２、Ｓ１１６和Ｓ１２０位點發(fā)生磷酸化可促進ＳＮＡｉｒ泛素化降解（ＵｂｉｑｕｉｔｉＡＩ１的失活［６８］。Ｆ－ｂｏｘ蛋白家族成員ＦＢＸＬ５、ＦＢＸＯｌｌ、ＦＢＸＬ１４通點的泛素化影響ＳＮＡＩ１核質轉運以及降解。ＦＢＸＬ５結合ＳＮＡＩ１邋Ｃ結構域，促進Ｎ末端Ｋ８５和Ｋ１４６位點的核內泛素化，穩(wěn)定ＳＮＡＳＮＡＩ１邋Ｋ２３４位點的泛素化則可以修復ＳＮＡＩ１與ＤＮＡ的結合［６９］。自身Ｎ－末端與ＳＮＡＩ１結合并促進其泛素化降解\　５保ǎ常裕潁悖鵒姿幔蔽壞愫�，Ｆn兀蹋保創(chuàng)俳櫻危粒桑卞澹文┒說模耍梗�、Ｋ１３ＹEⅲ耍保矗段壞惴核廝鼗到猓郟罰保蕁６櫻危粒桑幣燦耄牛停災械鈉淥家蜃有饔玫鶻謐家蜃櫻牛裕櫻畢嗷プ饔眉せ睿停停斜澩錚⑶銥梢災苯影邢蠔圖ひ徊郊せ睿櫻危粒桑幣員３鄭牛停緣某中校郟罰玻蕁ｅ義希冢睿疲簀義

本文編號：2745318