【摘要】：乳腺癌是女性癌癥患者中患病比例最高的異質(zhì)性惡性腫瘤,目前乳腺癌治療中面臨的主要困難是乳腺癌轉(zhuǎn)移以及腫瘤耐藥性,因此研究新型抗腫瘤轉(zhuǎn)移敏感性藥物將具有重要的臨床意義。開發(fā)已上市藥物的抗癌轉(zhuǎn)移功能及其分子機(jī)制是最為快速有效的方式。環(huán)孢素A(Cyclosporine A,CsA)是一種臨床中常用的免疫抑制劑,常用于器官移植后的抗排斥治療。近年來的研究發(fā)現(xiàn),環(huán)孢素A具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的功能,但也有統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示使用環(huán)孢素A人群中乳腺癌發(fā)病率低于普通人群,因此進(jìn)一步研究環(huán)孢素A在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制有助于拓展環(huán)孢素A的應(yīng)用。環(huán)孢素A通過與細(xì)胞內(nèi)的肽酰脯氨酰異構(gòu)酶蛋白家族,即親環(huán)素蛋白家族(Peptidylprolyl isomerase,或cyclophilin)發(fā)揮免疫抑制功能。近期的組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),親環(huán)素蛋白家族成員親環(huán)素類似蛋白2(Peptidylprolyl isomerase(cyclophilin)-like 2,PPIL2,即Cyp60、CYP4)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)絲F-actin的分布,并且是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)小RNAmiR-31的下游靶基因,說明PPIL2可能與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。本文旨在研究PPIL2在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的功能及可能性,以理解和探索環(huán)孢素A應(yīng)用于乳腺癌治療的可能性。本文主要研究內(nèi)容如下:(1)以人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D和ZR-75-30以及人類乳腺細(xì)胞MCF-10A為實(shí)驗(yàn)材料,通過相差顯微鏡成像、免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PPIL2表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)和F-actin分布存在相關(guān)性;通過細(xì)胞劃痕、Transwell侵襲小室、免疫印跡、免疫熒光和小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)表明,PPIL2抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。(2)通過免疫印跡、RT-PCR和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)PPIL2調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程相關(guān)的分子標(biāo)志物蛋白的表達(dá)水平,并通過下調(diào)EMT調(diào)節(jié)因子SNAI1蛋白水平,減少其在E-cadherin啟動(dòng)子上的結(jié)合,從而確定PPIL2負(fù)調(diào)控EMT過程。(3)以人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和ZR-75-30為實(shí)驗(yàn)材料,利用免疫共沉淀、哺乳動(dòng)物雙雜交證明細(xì)胞內(nèi)PPIL2結(jié)合SNAI1,利用GST-pulldown實(shí)驗(yàn)表明PPIL2和SNAI1存在直接相互作用;通過構(gòu)建PPIL2和SNAI1截短體表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)PPIL2的U-box結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)其與SNAI1的結(jié)合,SNAI1的氮末端介導(dǎo)其與PPIL2的結(jié)合。通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PPIL2和SNAII共定位在乳腺癌細(xì)胞核內(nèi)。(4)以人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和ZR-75-30為實(shí)驗(yàn)材料,通過免疫印跡、免疫共沉淀和核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPIL2通過促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)SNAI1的K48類型泛素化,降低其蛋白穩(wěn)定性,減少細(xì)胞內(nèi)SNAI1蛋白水平。(5)以人類乳腺癌細(xì)胞系ZR-75-30為實(shí)驗(yàn)材料,通過免疫印跡、免疫共沉淀、免疫熒光、細(xì)胞劃痕、Transwell侵襲小室和小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A通過PPIL2抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。(6)以人乳腺癌組織樣本為實(shí)驗(yàn)材料,通過免疫組織化學(xué)方法分析PPIL2與SNAI1在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義,發(fā)現(xiàn)PPIL2與SNAI1在乳腺癌組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性,并且PPIL2和SNAI1表達(dá)水平與乳腺癌組織的浸潤和轉(zhuǎn)移狀態(tài)具有顯著相關(guān)性。綜上所述,本論文揭示了 PPIL2通過影響F-actin分布和促進(jìn)SNAI1泛素化降解調(diào)控EMT及乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,并且環(huán)孢素A抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移依賴PPIL2進(jìn)行。該結(jié)果有助于進(jìn)一步理解環(huán)孢素A和親環(huán)素蛋白在乳腺癌中的功能,”為將環(huán)孢素A開發(fā)為新型抗癌藥物提供新的思考方向。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

［２１］。雖然目前調(diào)節(jié)三種ＥＭＴ的具體信號尚不完全清楚，但人們普遍認(rèn)同這三種ＥＭＴ過逡逑程具有顯著的功能差異（圖１．３）。逡逑１型ＥＭＴ主要發(fā)生在胚胎植入、胚胎發(fā)生和器官發(fā)育過程中。在胚胎發(fā)生和器官發(fā)逡逑育的早期階段，細(xì)胞在生長和分化過程中將經(jīng)歷幾輪ＥＭＴ和間充質(zhì)細(xì)胞－上皮轉(zhuǎn)化逡逑（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｔｒａｎｓｉｔｏｎ，邋ＭＥＴ）交替變化。囊胚是在發(fā)育初期形成的結(jié)構(gòu)，逡逑由外層的滋養(yǎng)細(xì)胞層，圍繞內(nèi)層的細(xì)胞團(tuán)和充滿液體的囊胚腔組成。在滋養(yǎng)細(xì)胞層逡逑ＥＭＴ被激活，促進(jìn)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜，激活胎盤功能。在囊胚內(nèi)，ＥＭＴ誘導(dǎo)內(nèi)層細(xì)胞逡逑團(tuán)進(jìn)入并沿著未來的中線遷移形成外胚層，中胚層和內(nèi)胚層，其中每層將逐步分化為逡逑身體結(jié)構(gòu)。ＥＭＴ也參與胚胎發(fā)育的后期，包括心臟瓣膜，骨骼肌和腭的形成。發(fā)育完逡逑－４－逡逑

邐Ｖｉｍｅｎｔｉｎ逡逑Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邐＾＾逡逑圖１．２邋ＥＭＴ過程中細(xì)胞形態(tài)變化逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｉｎ邋ＥＭＴ逡逑１．２．２邋ＥＭＴ的類型逡逑在２００７年波蘭ＥＭＴ會(huì)議和２００８年３月在冷泉港實(shí)驗(yàn)室舉行的會(huì)議上，根據(jù)ＥＭＴ發(fā)生逡逑的生物學(xué)過程及其導(dǎo)致的功能后果，討論了將ＥＭＴ分類為三種不同生物學(xué)亞型的建議逡逑［２１］。雖然目前調(diào)節(jié)三種ＥＭＴ的具體信號尚不完全清楚，但人們普遍認(rèn)同這三種ＥＭＴ過逡逑程具有顯著的功能差異（圖１．３）。逡逑１型ＥＭＴ主要發(fā)生在胚胎植入、胚胎發(fā)生和器官發(fā)育過程中。在胚胎發(fā)生和器官發(fā)逡逑育的早期階段，細(xì)胞在生長和分化過程中將經(jīng)歷幾輪ＥＭＴ和間充質(zhì)細(xì)胞－上皮轉(zhuǎn)化逡逑（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｔｒａｎｓｉｔｏｎ，邋ＭＥＴ）交替變化。囊胚是在發(fā)育初期形成的結(jié)構(gòu)，逡逑由外層的滋養(yǎng)細(xì)胞層，圍繞內(nèi)層的細(xì)胞團(tuán)和充滿液體的囊胚腔組成。在滋養(yǎng)細(xì)胞層逡逑ＥＭＴ被激活，促進(jìn)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜，激活胎盤功能。在囊胚內(nèi)，ＥＭＴ誘導(dǎo)內(nèi)層細(xì)胞逡逑團(tuán)進(jìn)入并沿著未來的中線遷移形成外胚層

親環(huán)素類似蛋白２調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。Ｓ１０４和Ｓ１０７位點(diǎn)的磷酸化可促進(jìn)了ＳＮＡＩ１蛋白出２、Ｓ１１６和Ｓ１２０位點(diǎn)發(fā)生磷酸化可促進(jìn)ＳＮＡｉｒ泛素化降解（ＵｂｉｑｕｉｔｉＡＩ１的失活［６８］。Ｆ－ｂｏｘ蛋白家族成員ＦＢＸＬ５、ＦＢＸＯｌｌ、ＦＢＸＬ１４通點(diǎn)的泛素化影響ＳＮＡＩ１核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及降解。ＦＢＸＬ５結(jié)合ＳＮＡＩ１邋Ｃ結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)Ｎ末端Ｋ８５和Ｋ１４６位點(diǎn)的核內(nèi)泛素化，穩(wěn)定ＳＮＡＳＮＡＩ１邋Ｋ２３４位點(diǎn)的泛素化則可以修復(fù)ＳＮＡＩ１與ＤＮＡ的結(jié)合［６９］。自身Ｎ－末端與ＳＮＡＩ１結(jié)合并促進(jìn)其泛素化降解\�。当（３Ｔ}悖鵒姿幔蔽壞愫螅疲攏兀蹋保創(chuàng)俳櫻危粒桑卞澹文┒說模耍梗�、Ｋ１３ＹEⅲ耍保矗段壞惴核廝鼗到猓郟罰保蕁６櫻危粒桑幣燦耄牛停災(zāi)械鈉淥家蜃有饔玫鶻謐家蜃櫻牛裕櫻畢嗷プ饔眉せ睿停停斜澩錚⑶銥梢災(zāi)苯影邢蠔圖ひ徊郊せ睿櫻危粒桑幣員３鄭牛停緣某中校郟罰玻蕁ｅ義希冢睿疲簀義

本文編號：2745318