【摘要】：前列腺癌是威脅人類健康的主要癌癥之一,在歐洲和美國,前列腺癌的發(fā)病率多年來一直位居男性惡性腫瘤的首位,死亡率居第二位。雖然中國前列腺癌發(fā)病率低于歐美等國家,但近年來,隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)改變、醫(yī)療診斷技術(shù)水平的提高和醫(yī)療體檢的普及,我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。據(jù)估計,2015年我國前列腺癌新發(fā)病例約60300例,死亡病例約26600例。前列腺癌的傳統(tǒng)的治療為雄激素剝奪療法,利用藥物或手術(shù)方法降低病人的體內(nèi)雄激素水平,從而達到治療前列腺癌的目的。遺憾的是,在經(jīng)過12-18個月的中位治療時間后,大多數(shù)病人最終轉(zhuǎn)歸為去勢/激素抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。一旦出現(xiàn)激素抵抗,就目前的治療水平來說,激素抵抗性前列腺癌對化學治療和放射治療皆不敏感,從而導致CRPC患者面臨內(nèi)分泌治療無效后生活質(zhì)量降低、生存期縮短等一系列影響。因此,研發(fā)新的有效的前列腺癌治療藥物和治療手段成為CRPC前列腺癌治療中亟待解決的關(guān)鍵問題。近年來,基于促進腫瘤細胞凋亡、改變細胞內(nèi)信號傳導途徑等機制的分子靶向治療、基因治療方法受到人們的重視,如國內(nèi)外學者楊高毅等研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)bcl-2蛋白可以誘導前列腺癌細胞凋亡,并且發(fā)現(xiàn)bcl-2反義寡核苷酸oblimersensodium聯(lián)合多烯紫杉醇治療激素難治性前列腺癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究也顯示出良好的治療效果。另外,攜帶可溶性人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)基因的腺病毒可引起人體內(nèi)腫瘤細胞發(fā)生明顯的凋亡。其中,TRAIL引起了人們的關(guān)注。國內(nèi)外對TRAIL及其介導的細胞凋亡途徑的研究表明,TRAIL或其胞外域降解形成可溶性的細胞因子sTRAIL(Soluble TRAIL)可作用于靶細胞表面的死亡受體DR4和DR5而形成死亡誘導信號復合體,并激活caspase8及其下游的caspase級聯(lián)反應,然后啟動死亡受體途徑和線粒體依賴的凋亡途徑。其中死亡受體途徑最終通過激活caspase3等效應酶,作用于蛋白激酶C(PKC)等底物而導致細胞凋亡。而線粒體依賴途徑是通過形成有活性的tBid(truncated BID),使線粒體釋放cytC等凋亡相關(guān)因子,再通過caspase3,7誘導腫瘤細胞凋亡。bcl2是該途徑的抑制因子之一。另外,一些腫瘤細胞高表達誘騙受體DcR1、DcR2,它們可與DR4/DR5競爭同TRAIL的結(jié)合,抑制TRAIL介導的細胞凋亡,使腫瘤細胞表現(xiàn)出對TRAIL的耐受。然而,近年來,盡管人類等脊椎動物TRAIL蛋白的抗癌作用已有較多研究報道,但對前列腺癌PC3細胞的促凋亡作用則罕見報道,對其作用的詳細的分子機制則未見報道,而對貝類等無脊椎動物的TRAIL基因及其重組蛋白的抗腫瘤功能國際上則更沒有報道。在先前利用RT-PCR技術(shù)克隆池蝶蚌的免疫相關(guān)基因的過程中,我們獲得了雙殼貝類池蝶蚌的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(sTRAIL)基因的部分序列,并發(fā)現(xiàn)該TRAIL有一定的抗腫瘤特性。為深入探討貝類sTRAIL基因的抗腫瘤作用及其可能的作用機制,我們擬通過本項目的研究進一步確定池蝶蚌的sTRAIL在抗腫瘤,即促進前列腺癌細胞PC3細胞凋亡方面的功能作用,并揭示其作用的死亡受體信號傳導途徑等可能的作用機制,從而將該蛋白作為新型抗癌藥物,以及將TRAIL和相關(guān)信號分子作為靶向治療的有效靶點運用于前列腺癌等癌癥的治療實踐方法:1.利用RT-PCR和western-blot技術(shù)克隆池蝶蚌sTRAIL基因序列,并對sTRAIL基因進行原核表達、純化獲得多克隆抗體。2.利用不同濃度的(10ng-10 u g)河蚌sTRAIL重組蛋白對該細胞進行誘導刺激,利用流式細胞儀檢測和DNAladder等檢測法對sTRAIL誘導刺激0-96h后PC3的細胞凋亡現(xiàn)象進行了分析。3利用Real-time實時定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測sTRAIL重組蛋白誘導/未誘導的腫瘤細胞(PC-3)的DR4、DR5、DcR1、DcR2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達變化。4 分別用 caspase8 抑制劑 Z-AEVD-FMK 和 caspase3 抑制劑 Ac-DEVD-CHO 處理經(jīng)sTRAIL誘導的PC-3細胞,利用上述方法檢測細胞凋亡情況,并檢測抑制劑處理前后caspase8、caspase3、PKC等分子在mRNA和蛋白水平表達的變化。5在上述對死亡受體、caspase信號途徑研究的基礎(chǔ)上,用PKC抑制劑,Staurosporine處理經(jīng)sTRAIL誘導的PC-3細胞,利用Real-time實時定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測細胞凋亡和抑制劑處理前后PKC等基因表達的變化。6.檢測sTRAIL誘導后,PC-3細胞中抗凋亡因子bcl-2基因表達水平的變化。用bcl-2抑制劑(ABT-737,5nM)處理后,再次檢測凋亡率。結(jié)果:1克隆了池蝶蚌sTRAIL蛋白序列,并證實了 sTRAIL蛋白對PC3細胞的毒性作用。2河蚌sTRAIL對PC3細胞具有較強的細胞毒性作用,可誘導PC3細胞發(fā)生顯著的細胞凋亡,隨著sTRAIL濃度和誘導時間的增加,PC3細胞的凋亡率逐漸增加,呈現(xiàn)明顯的劑量與時間效應,其中100ngsTRAIL誘導組中,24h細胞凋亡率可達23.7%以上,并可檢測到DNA ladder的形成。3對sTRAIL誘導后,PC3細胞中死亡受體DR4和DR5均有表達,但DR4較高;而誘騙受體DcR1和DcR2不表達.4 sTRAIL誘導可引起caspase8、caspase3基因表達水平的顯著上調(diào),同時伴隨凋亡率的增加;用caspase8抑制劑Z-IETD-FMK或caspase 3抑制劑Ac-DEVD-CHO分別處理,均能顯著下調(diào)凋亡率。5sTRAIL誘導可引起PKC基因表達水平的上調(diào),但不顯著;PKC抑制劑(Saurosporine)處理后,凋亡率明顯下降,但仍顯著高于對照組。6sTRAIL誘導后24h內(nèi)可引起bcl-2表達上調(diào),但不顯著;用bcl-2抑制劑(ABT-737)處理后,凋亡率明顯增加。結(jié)論:確定了池蝶蚌sTRAIL對前列腺癌細胞株(PC3)的促凋亡作用,并分析了sTRAIL誘導前列腺癌細胞株(PC3)發(fā)生細胞凋亡的死亡受體途徑中相關(guān)的死亡受體、caspases、PKC、Bcl-2等分子的作用,確定了 TRAIL、DR4和bcl-2可作為PC3細胞靶向治療的新靶點。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25
【圖文】：

結(jié)果逡逑２．１邐ＲＮＡ提取逡逑提取了河蚌的總ＲＮＡ，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖１所示�？煽吹藉义蟽蓷l以上的條帶，分別為５Ｓ和１８ＳｒＲＮＡ，說明所提取的ＲＮＡ完整性較好。另逡逑夕卜，經(jīng)過測定，實驗中提取的總ＲＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０全部在２．０左右，這也逡逑表明我們所提取的ＲＮＡ的純度較氋。逡逑}楨義賢跡保遙危撂崛〗峁治鰣義嫌鏡潰焙停玻哄澹遙危燎碇塹纈窘峁義希玻插危螅裕遙粒桑袒虻模校茫依┰鰣義弦隕鮮鱟埽遙危練醋嫉玫降模悖模危廖０�，利用ＰＣＲ扩札}竦昧私擔埃埃猓皰義洗笮〉鈉危ㄈ繽跡菜荊�，符猴@て�。辶x希灣澹卞義稀觥觥鰣義希玻瑰義

本文編號：2744840