【摘要】：背景和目的卵巢癌(OVCA)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。由于卵巢在盆腔內位置較深,卵巢癌早期又缺乏特異性癥狀,卵巢癌已是女性死于癌癥相關疾病的第五大原因,是幾十年困擾臨床醫(yī)生和研究者的難題。這主要是由于缺少疾病的早期檢測方法,導致原發(fā)腫瘤快速地具有侵略性地細胞腹膜擴散,致使大多數患者的不良預后。獲得遷移和侵襲能力是公認的卵巢癌細胞轉移的一個必要的先決條件,但導致卵巢癌細胞轉移的確切分子機理尚未得到很好的闡明�；熕幬锬退幮允悄[瘤治療中一個嚴峻的問題,因為許多腫瘤對使用的一些細胞毒試劑本質上是耐受的,而其余腫瘤,盡管它們最初是敏感的,在重復使用抗腫瘤試劑后,最終對抗腫瘤試劑產生耐受性。對卵巢癌,在腫瘤的最佳切除手術和標準化療后,晚期疾病患者增加5年生存率。盡管卵巢癌對化學治療相對敏感,但臨床上化學治療經常遭遇耐藥性。這種獲得性耐藥性的發(fā)展成為成功治療的主要限制。因此,迫切需要確定腫瘤細胞對化療藥物耐藥機制以研制新的藥物重新提高腫瘤細胞對主要化療的靈敏度。近期對食管鱗狀細胞癌,膀胱癌,胰腺癌和卵巢癌的研究表明,轉錄因子Slug是侵襲過程和致癌過程中的重要操縱子。在膽管癌細胞中,Slug沉默能夠增強細胞對順鉑和輻射的敏感性。在卵巢癌中,Slug也能調控抗輻射和藥物抗性。因此,我們認為Slug可能是一個有效的基因靶。丙泊酚(2,6一二異丙基苯酚),是一種能夠產生平穩(wěn)誘導且能迅速蘇醒的最常用的靜脈麻醉藥,自上世紀八十年代末引進國內,現已廣為接受。除了具有多種麻醉優(yōu)越性,丙泊酚還能發(fā)揮一些非麻醉劑的作用。丙泊酚可通過調節(jié)Rho A抑制癌細胞的侵襲能力,暗示它可能是癌癥手術中完美的麻醉劑。在肺癌細胞中,體外實驗證明丙泊酚可阻止MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達,從而抑制侵襲和遷移。在結腸癌細胞中,丙泊酚促進抑制癌細胞的侵襲部分是由于ERK1/2-依賴的金屬蛋白酶減量調節(jié)。我們最近報道了丙泊酚使NF-κB信號通路失活可以廢除吉西他濱誘導的NF-κB活性活化,結果導致了胰腺腫瘤的化療增敏作用。然而,在膽囊癌中,丙泊酚卻通過活化Nrf2誘導增殖和促進入侵。在本研究中,我們用對紫杉醇敏感的和耐藥的卵巢癌細胞株在體外檢測了丙泊酚對細胞侵襲和誘導細胞凋亡的影響,同時觀測slug水平與之相關性。以期探明丙泊酚是否對卵巢癌細胞侵襲具有抑制作用；是否能夠促進紫杉醇誘導的卵巢癌細胞凋亡；轉錄因子Slug是否是丙泊酚抑制卵巢癌細胞侵襲并促進紫杉醇誘導的卵巢癌細胞凋亡的一個有效的基因靶。材料和方法1.細胞與細胞培養(yǎng)人卵巢癌細胞株HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2。SKOV-3和OVCAR-3細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中,加10%熱滅活胎牛血清,50μg/mL慶大霉素和1mmol/L丙酮酸鈉。HO-8910PM, HO-8910, COC1和ES-2培養(yǎng)在RPMI培養(yǎng)基中,加10%胎牛血清,1%青霉素/鏈霉素和1%L-谷氨酰胺。所有的細胞都是在37℃含有5%的CO2的細胞培養(yǎng)箱中。2.藥物暴露將對數生長期的細胞接種于96孔板,5×103個細胞/孔。孵育24小時后,用含有一系列濃度紫杉醇(0.01-10μmol/L)或丙泊酚(0.1-10μg/mL)的含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)72小時做劑量依賴分析。時間依賴的測定,5×103個細胞/孔在含10μmol/L紫杉醇或5μg/mL丙泊酚的5%胎牛血清MEM培養(yǎng)基中孵育24-72h。采用MTT法測定剩余活細胞的相對數。TUNEL染色法檢測細胞凋亡3.化學敏感性試驗細胞接種于96孔板,5×103個細胞/孔。孵育24小時后,培養(yǎng)基替換為含5μg/ml丙泊酚的5%胎牛血清MEM,額外孵育24小時,將細胞暴露于0.1μmol/L的紫杉醇溶液48小時。剩余活細胞的相對數量采用MTT法測定。TUNEL染色法檢測凋亡細胞。4.MTT實驗5×103個細胞/孔種板,每組設置3個重復孔,按上述方法作用標示時間后,每孔添加10μL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-二苯基溴化物),避光培養(yǎng)4小時。吸出培養(yǎng)基MTT混合物,每孔添加150μL MTT溶劑(0.1 N鹽酸無水異丙醇)。室溫搖床孵育10分鐘,用移液管充分混合直到所有的甲晶體溶解。以690 nm處的吸光度為背景測量570 nm的吸光度變化。從570 nm的吸收值減去690 nm的吸收值以獲得最終的吸收值。5. TUNEL實驗上述細胞1×104個,在指定的時間移至玻片培養(yǎng)24小時。細胞凋亡根據制造商的說明用TUNEL法評價。所有試驗均一式四份。6.細胞侵襲實驗侵襲實驗,HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2細胞,用0.1-10微克/毫升丙泊酚處理72小時,或5微克/毫升的丙泊酚處理24-72小時。然后2×103個上述細胞在無血清培養(yǎng)基中添加到每個插條的內部。板在5%的二氧化碳中37℃孵育24小時后,將插條中的介質移除,并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗插條。插條膜用冷甲醇固定10分鐘,在25%甲醇中用0.5%結晶紫染色10分鐘,水沖洗除去多余的染料。將膜從插條內移出,放在顯微鏡下,清點遷移通過多孔膜的細胞數量。7.蛋白質印跡分析蛋白質印跡分析,用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細胞二次,并在細胞裂解液中裂解30分鐘。樣品超聲處理30秒,離心力12000×g,4℃離心20 min。樣品經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后在硝酸纖維素膜上電泳印跡。膜被阻擋在含5%牛奶的TBS/吐溫-20緩沖液,并和稀釋在TBS/吐溫-20/BSA(牛血清白蛋白)中的初次抗體在4℃下孵育一夜。隨后的要素是抗-slug。所有印跡與結合辣根過氧化物酶(HRP)(2000/1)的二抗一起孵育,使用增強的化學發(fā)光法(ECL)培養(yǎng)。采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。8.統(tǒng)計分析統(tǒng)計上的顯著差異由配對t檢驗和單因素方差分析檢測,定義P0.05。所有實驗均獨立地重復至少三次。結果1.卵巢癌(OC)細胞系對紫杉醇耐藥性的變化我們體外研究了六個卵巢癌細胞系(HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2)對紫杉醇的相對靈敏度。卵巢癌細胞用不同濃度的紫杉醇處理72小時,存活細胞數用MTT法分析。由此,對HO-8910PM, OVCAR-3和SKOV-3細胞,紫杉醇的LD5010微摩爾/升,HO-8910,COC1和ES-2細胞的LD50為0.1微摩爾/升左右。當用TUNEL法分析紫杉醇對細胞凋亡的影響時獲得同樣敏感性。這些數據支持將HO-8910PM, OVCAR-3和SKOV-3細胞株對紫杉醇耐藥,HO-8910, COC1和ES-2細胞株對紫杉醇敏感的分類。2.卵巢癌細胞系的slug水平為了檢驗slug基底水平可以預測紫杉醇的敏感性這一假設,我們最初通過蛋白質印跡試驗評估卵巢癌細胞系slug水平。Slug蛋白含量最高的是HO-8910PM, OVCAR-3和SKOV-3細胞,slug蛋白水平最低的是 HO-8910, COC1和ES-2細胞。因此,卵巢癌細胞表現出升高的slug,耐藥細胞對敏感性細胞株有一致的slug模式,紫杉醇敏感細胞對紫杉醇耐藥細胞slug有一致的差異。3.紫杉醇治療增加敏感細胞中slug的表達但對耐藥細胞無作用HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2細胞分別以0.001,0.01,0.1,1,10微摩爾/升紫杉醇處理24小時,用蛋白質印跡法檢測slug。用0.001-10微摩爾/升紫杉醇處理24小時對耐藥的HO-8910PM, OVCAR-3, SKOV-3細胞中slug水平無顯者影啊。然而,對紫杉醇敏感的HO-8910, COC1和ES-2細胞,用0.1微摩爾/升的紫杉醇處理24小時slug的水平顯著增加。4.丙泊酚治療可抑制耐藥細胞的細胞侵襲但不作用于敏感細胞全身麻醉丙泊酚血漿靶濃度在3至8μg/mL之間。在本研究中,卵巢癌HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2細胞用0.1-10μg/mL丙泊酚處理72小時,或5μg/mL的丙泊酚處理24-72小時。抑制入侵的劑量依賴方式和時間依賴方式-在紫杉醇耐藥的卵巢癌HO-8910PM, OVCAR-3, SKOV-3細胞,5-10μg/mL丙泊酚的濃度足以抑制癌細胞的侵襲能力。而在紫杉醇敏感細胞HO-8910, COC1和ES-2中丙泊酚的抑制效應不明顯。5.丙泊酚治療可抑制耐藥細胞的細胞增殖和促進細胞凋亡但對敏感細胞不起作用HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2細胞經0.1-10μg/mL丙泊酚處理24、48和72小時。丙泊酚降低紫杉醇耐藥細胞HO-8910PM, OVCAR-3, SKOV-3的增殖,MTT法檢測其具有時間依賴和劑量依賴行為。用TUNEL法進行細胞凋亡分析,丙泊酚促進紫杉醇耐藥細胞HO-8910PM, OVCAR-3和SKOV-3的凋亡。在紫杉醇敏感的HO-8910, COC1和ES-2細胞中無顯著效果。6.紫杉醇治療后丙泊酚對耐藥性和敏感性細胞中的slug均能抑制因為5μg/mL丙泊酚處理48小時后能顯著抑制卵巢癌細胞侵襲并促進卵巢癌細胞凋亡。因此,我們用5μg/mL丙泊酚處理48小時做進一步的研究。HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3,OVCAR-3, COC1和ES-2細胞經5μg/mL丙泊酚處理48小時。細胞中Slug蛋白顯著地或完全地被抑制。雖然0.1μmol/L紫杉醇治療24小時后顯著增加了對紫杉醇敏感的HO-8910, COC1口ES-2細胞的slug水平,5μg/mL丙泊酚預處理則完全抑制0.1μmol/L紫杉醇治療48小時后Slug蛋白。7.丙泊酚增強紫杉醇對耐藥和敏感細胞誘導的細胞凋亡丙泊酚治療會增加卵巢癌細胞系對紫杉醇促成的細胞凋亡的敏感性,為了檢驗這一假設,卵巢癌HO-8910PM, HO-8910, SKOV-3, OVCAR-3, COC1和ES-2細胞用5μg/mL丙泊酚預處理24小時,然后檢測其單獨作用及其和0.1μmol/L濃度的紫杉醇的聯合作用。丙泊酚聯合0.1μmol/L濃度的紫杉醇治療顯著降低細胞數且在體外增加所有卵巢癌細胞的細胞凋亡。結論我們的研究發(fā)現,丙泊酚治療可抑制卵巢癌細胞侵襲和促進卵巢癌細胞凋亡,并促進紫杉醇殺死所有對紫杉醇敏感的和耐藥的卵巢癌細胞。觀察到基底slug水平和紫杉醇敏感性之間具有顯著的相關性。紫杉醇治療增加slug的水平。結果表明,通過抑制slug,丙泊酚抑制卵巢癌細胞侵襲和轉移,提高紫杉醇誘導的卵巢癌細胞凋亡。這些結果顯示,丙泊酚可能是理想的卵巢癌手術麻醉劑且是有用的卵巢癌治療增敏劑。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R614;R737.31

【參考文獻】

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3 周橋靈;古妙寧;楊承祥;劉洪珍;王漢兵;梁樺;賴曉紅;趙偉成;張文璇;;丙泊酚抑制人肝癌HepG2細胞的粘附及遷移[J];臨床麻醉學雜志;2013年09期

4 張靈敏;張明鑫;王寧;段小藝;周蘇娜;王健生;景桂霞;;小劑量丙泊酚對食管鱗癌細胞Eca109生物學行為的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2011年04期

本文編號：2744730