【摘要】：目的:本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探索胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌(GNEC)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀,并以GNEC特異性上調(diào)表達(dá)的Neuro D1為焦點,探討其在GNEC中的表達(dá)及其對GNEC生物學(xué)功能的影響。方法:本研究采用新一代高通量測序技術(shù)RNA-seq對研究的組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序;采用RT-qPCR和western blot技術(shù)分別檢測Neuro D1的m RNA和蛋白表達(dá)情況;采用免疫組化法檢測Neuo D1在50例GNEC患者石蠟組織切片中的表達(dá)情況并做相關(guān)的預(yù)后分析;采用CCK8法和SRB法檢測細(xì)胞的增殖能力;采用平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力。結(jié)果:(1)本研究共檢測了3對GNEC患者的癌與毗鄰癌旁組織以及與3例GNEC臨床基本狀況(性別、年齡、腫瘤分期)相匹配的3例胃腺癌(GAC)患者的癌組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息,并對其轉(zhuǎn)錄組景觀進(jìn)行展示;通過比對GNEC癌與癌旁以及GNEC癌與GAC癌的差異表達(dá)基因,得出GNEC特異性表達(dá)的上調(diào)基因1248個,下調(diào)基因6個;并對差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO等分析。(2)Neuro D1是GNEC特異性上調(diào)表達(dá)基因之一,其參與神經(jīng)與神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)的多個進(jìn)程;Neuro D1在GNEC中的m RNA水平和蛋白水平均呈高表達(dá)狀態(tài),且在50例的免疫組化結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)Neuro D1高表達(dá)影響GNEC患者的預(yù)后;我們隨后對Neuro D1在GNEC中的功能進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)敲弱Neuro D1在GNEC細(xì)胞系中的表達(dá)會促進(jìn)細(xì)胞的增殖與克隆形成,且會提高GNEC細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。結(jié)論:GNEC的轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀存在組織特異性,其特異性表達(dá)基因Neuro D1不僅影響GNEC患者的遠(yuǎn)期預(yù)后且也會影響GNEC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力以及對5-Fu的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

用 DESeq2 進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，對表達(dá)差異分析結(jié)果進(jìn)行可視異基因映射到 STRING 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)于差異分析結(jié)果，繪制韋恩圖、熱圖，并進(jìn)行聚類分析。因富集分析用 topGO 進(jìn)行 GO 富集分析，并繪制顯著性 GO 有向無環(huán)圖；用 clusterProfiler 進(jìn)行 KEGG 通路和 KOG 分類富集分析；于基因功能富集分析結(jié)果繪制關(guān)聯(lián)分析網(wǎng)絡(luò)圖。建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建用的干擾載體 pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA 載體圖譜如下。用 I 酶切切去 U6 啟動子下游的 ccdB 毒性基因，插入待構(gòu)建的 shR

結(jié) 果內(nèi)分泌癌組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究組學(xué)研究的樣本信息與 RNA-seq 測序質(zhì)控面了解 GNEC 的轉(zhuǎn)錄組景觀，我們收集了 3 對 GNEC 腫瘤組其毗鄰的癌旁組織（N1、N2、N3），并根據(jù) 3 個 GNEC 患者的分期等作為配對因素，挑選了 3 個與之匹配的 GAC 患者的腫T8）同期進(jìn)行 RNA-seq（圖 1.1）。我們首先對測序結(jié)果進(jìn)行用堿基測序質(zhì)量值(Phred quality score, Qphred)描述整體測序g error probabilities, P)進(jìn)行質(zhì)量評估，評估標(biāo)準(zhǔn)見表 1.1。測序量平均約為 49088352 個（表 1.2）；為保證數(shù)據(jù)的分析質(zhì)量，量的序列過濾清除，最終得到凈讀段數(shù)（表 1.3）；讀段長度，將所有讀段與人類基因組進(jìn)行有參比較，共定位到基因數(shù)（表 1.4）。

圖 1.2 各 RNA-seq 樣本的讀段在基因組中的結(jié)構(gòu)分布2 單核苷酸多態(tài)性分析單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)是指基因組中由單個核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記，通常發(fā)生的數(shù)量較多，且多態(tài)性豐富。SNP 常發(fā)生的變異類型只有兩種，即轉(zhuǎn)換和顛換（圖 1.3）。從圖中可以看出不管是 GNEC 的癌組織、癌旁組織還是 GAC 的癌組織，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生的數(shù)量遠(yuǎn)多于堿基顛換且在 GNEC 癌組織中偏好發(fā)生的轉(zhuǎn)換類型為腺嘌呤轉(zhuǎn)（A）為鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）轉(zhuǎn)為胞嘧啶（C）。進(jìn)一步對 SNP 位點進(jìn)行基因組定位可以發(fā)現(xiàn) SN最經(jīng)常發(fā)生的位置多集中在內(nèi)含子中（圖 1.4）。對 SNP 數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計可以發(fā)現(xiàn)，GNEC 中發(fā)生 SNP 的數(shù)量最多，且其特有的 SNP 數(shù)高達(dá) 18150 個（表 1.5）。

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本文編號：2744419