【摘要】：卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤,其死亡率高居所有婦科惡性腫瘤之首。卵巢癌患者早期通常無明顯癥狀,這使其早期診斷較為困難,且疾病后期易發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移,導致卵巢癌死亡率一直居高不下�，F(xiàn)有的手術(shù)治療與化療可在一定程度上減少卵巢癌患者的腫瘤負荷,但卻無法顯著改善患者的遠期生存。究其根本,在于我們對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不完全清楚。目前卵巢癌的診治仍是臨床一大難題,主要原因是缺乏針對卵巢癌的特異性高、敏感性好的早期篩查方法,且在卵巢癌的后期治療過程中易發(fā)生復發(fā)及化療耐藥。尋找可用于卵巢癌早期篩查的特異性分子和新的卵巢癌治療靶點將有助于改善卵巢癌的預后,因此,對卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中分子機制的研究迫在眉睫。DNA損傷修復是指在基因組DNA受到損傷后發(fā)生的一系列修復過程。DNA損傷包括內(nèi)源性損傷,如細胞代謝產(chǎn)物的損傷,以及外源性損傷,如輻射或化療藥物造成的損傷。DNA損傷修復在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起到的作用有其兩面性,它可能造成基因組DNA錯誤而誘發(fā)腫瘤,但同時,放化療過程也是利用化療藥物和放療對腫瘤細胞產(chǎn)生的DNA損傷所發(fā)揮治療作用；DNA損傷修復失敗可能是腫瘤發(fā)生的誘發(fā)因素,而對于放化療過程產(chǎn)生的DNA損傷修復也會導致腫瘤細胞的放化療耐受。所以,DNA損傷修復對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響。卵巢癌根據(jù)臨床病理和分子遺傳學特點可劃分為2種類型：Ⅰ型多為臨床早期病變,局限于卵巢,發(fā)展緩慢,預后較好；Ⅱ型具有高度侵襲性,發(fā)現(xiàn)時多為臨床晚期,預后不良�；诼殉舶┑牟煌愋瓦M行蛋白質(zhì)組學分析并獲取表達差異蛋白的結(jié)果,我們從中挑選出MDDC1 (Mediator of DNA damage checkpoint protein 1)和YAP1 (Yes-associated proteinl)這兩個DNA損傷修復相關(guān)基因作為本研究的目標分子,探討其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制。第一部分DNA損傷修復相關(guān)基因MDC1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究研究背景和目的DNA損傷修復過程是腫瘤生物學中的一個重要研究領(lǐng)域。一方面,在理論上人們逐漸認識并接受“DNA損傷修復反應是機體早期抵抗腫瘤發(fā)生的重要防線”這一觀點,因為參與DNA損傷應答反應的許多基因,如p53和BRCA1等,都是經(jīng)典的抑癌基因,DNA損傷發(fā)生后若細胞不能進行有效應答反應以保持基因組遺傳穩(wěn)定性,則易發(fā)生基因突變導致腫瘤發(fā)生；另一方面,在臨床上利用放療、化療等手段來治療腫瘤正是利用DNA損傷來殺傷腫瘤細胞從而達到治療目的。在前期對上皮性卵巢癌的不同類型進行蛋白質(zhì)組學分析所得到的結(jié)果中,將卵巢癌不同類型間表達差異蛋白數(shù)據(jù)集,與卵巢癌和正常組織對照表達差異蛋白數(shù)據(jù)集,取交集獲得MDC1分子。我們發(fā)現(xiàn)MDC1這一參與DNA損傷應答反應的重要分子在,因此我們推測它可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有一定作用。近年來在對其它腫瘤的研究中,MDC1被發(fā)現(xiàn)可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。有研究指出MDC1參與食管癌細胞增殖和細胞周期調(diào)控,并對化療藥物阿霉素和順鉑的敏感性產(chǎn)生影響,提示MDCl可以作為食管癌的一個潛在治療靶點。而Yuan等通過干擾MDC1也驗證了MDC1對宮頸癌細胞增殖、細胞周期調(diào)控和阿霉素藥物敏感性的影響,提示其調(diào)控宮頸癌發(fā)展過程中的重要進程。另外,MDC1在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中同樣發(fā)揮著重要作用。這些研究進一步支持了我們的推測,表明MDC1可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。對MDC1的研究,將有助于我們更好地理解卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程的分子機制,并有可能為卵巢癌的治療提供新的靶點,以改善卵巢癌的預后。研究方法本課題為了探究MDC1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用,首先從組織學角度檢測MDC1表達水平與預后的關(guān)系。然后從體外實驗角度,通過上調(diào)和下調(diào)目的基因MDC1的表達水平,進而研究其發(fā)生的生物學行為改變,如MDC1在卵巢癌中是否起到調(diào)節(jié)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的作用,是否影響腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等,并在體內(nèi)實驗水平進一步驗證體外實驗結(jié)果。研究結(jié)果1.MDCl表達水平與卵巢癌預后的關(guān)系為探究卵巢癌中MDC1表達水平與預后的關(guān)系,我們對130例卵巢癌石蠟組織切片進行免疫組化檢測,根據(jù)其表達水平分為MDC1高表達和低表達組,并進行生存分析。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明,MDC1高表達組明顯較MDC1低表達組預后差(P=0.0052)。通過對MDC1高表達和低表達組之間患者年齡、FIGO分期等潛在相關(guān)因素的進一步分析,我們發(fā)現(xiàn)MDC1高表達組年齡較低表達組偏低(P=0.043),而與其他因素則無明顯相關(guān)性。2.MDC1干擾及過表達細胞系的構(gòu)建我們成功構(gòu)建了MDCl干擾載體pGIPZ-shMDC.1和過表達載體pLenti-MDC1,并從mRNA和蛋白水平檢測MDC1在卵巢癌不同細胞系中的表達,選取MDC1表達水平較高的HO8910PM和OVCAR3細胞系進行干擾,選取MDC1低表達細胞系H08910進行過表達,通過細胞轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定篩選等方法獲得MDC1干擾及過表達的卵巢癌細胞系。3.MDC1增強卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力我們利用Transwell實驗檢測MDC1干擾及過表達后對細胞遷移侵襲能力的影響。結(jié)果顯示MDC1干擾細胞系shMDC1-HO8910PM和shMDC1-OVCAR3的遷移和侵襲能力明顯降低,而過表達細胞系MDC1-OVE-HO8910的遷移和侵襲能力則顯著增強。證明MDC1在卵巢癌中具有促進腫瘤遷移侵襲的能力。4.MDC1促進卵巢癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)通過對MDC1干擾及過表達細胞系的形態(tài)學觀察,我們發(fā)現(xiàn)過表達MDC1的卵巢癌細胞系與對照細胞相比呈梭形間葉性細胞形態(tài),而MDC1干擾細胞系與對照細胞相比則趨向于多邊形上皮樣形態(tài),提示MDC1可能促進卵巢癌細胞系的EMT。Western Blot及細胞免疫熒光結(jié)果提示,MDCl干擾后上皮性標志分子E-cadherin (E鈣黏蛋白)表達上調(diào),而間質(zhì)標志分子N-cadherin (N鈣黏蛋白)等表達下調(diào),MDC1過表達細胞系則相反,這進一步驗證了MDC1能夠促進卵巢癌細胞的EMT。5.體內(nèi)實驗驗證MDC1促進卵巢癌遷移侵襲能力用MDC1干擾細胞系shMDC1-HO8910PM建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型,從體內(nèi)實驗水平驗證MDC1對卵巢癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移能力的影響。實驗結(jié)果顯示shMDCl-HO8910PM組的裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯少于對照組,這從體內(nèi)實驗的角度證實了MDC1促進卵巢癌的浸潤轉(zhuǎn)移。6.MDC1不影響卵巢癌細胞系的細胞周期和凋亡流式細胞術(shù)檢測細胞周期改變,發(fā)現(xiàn)小干擾RNA (siRNA)干擾MDC1后卵巢癌細胞系周期分布與對照細胞相比并無明顯變化。同理,siRNA干擾MDCl后用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,發(fā)現(xiàn)干擾后卵巢癌細胞凋亡數(shù)量與對照細胞相比也無明顯改變。以上結(jié)果說明MDC1并不影響卵巢癌細胞的細胞周期和凋亡。7.MDC1與順鉑(CDDP)、阿霉素(ADR)藥物敏感性無相關(guān)性利用四唑鹽比色法(MTT)實驗檢測MDC1干擾后,卵巢癌細胞對化療藥物CDDP和ADR的敏感性,發(fā)現(xiàn)干擾MDC1對藥物敏感性并無明顯影響。結(jié)論1.MDC1的表達水平與卵巢癌預后相關(guān),MDC1高表達提示預后較差。2.MDC1通過增強上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而促進卵巢癌的浸潤轉(zhuǎn)移。3.MDCl不影響卵巢癌細胞周期和凋亡,且與CDDP和ADR藥物敏感性無關(guān)。第二部分DNA損傷修復相關(guān)基因YAP1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究研究背景和目的YAP1是Hippo信號轉(zhuǎn)導通路下游重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子。Hippo信號通路主要通過促進細胞凋亡和抑制細胞增殖調(diào)控器官發(fā)育大小,而YAP1是該信號通路的靶因子。YAP1在哺乳動物中功能域保守,在組織和器官中廣泛表達,在正常細胞中發(fā)揮著信號轉(zhuǎn)導和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,同時參與細胞增殖和細胞凋亡的調(diào)控。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)YAP1在多種惡性腫瘤中高表達,可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。同時,YAP1也是參與DNA損傷修復的關(guān)鍵基因,有研究表明,YAP家族作為轉(zhuǎn)錄因子能夠參與DNA損傷修復,并提示該機制可能與臨床化療敏感性相關(guān)。結(jié)合蛋白質(zhì)組學相關(guān)研究結(jié)果,我們推測對YAP1的研究將有助于解釋卵巢癌細胞生長機制,同時為卵巢癌臨床治療提供新的靶點。研究方法通過免疫組化檢測YAP1在卵巢癌組織中的表達,分析YAP1表達位置、表達水平與預后的關(guān)系。通過上調(diào)和下調(diào)YAP1基因的表達水平,對YAP1干擾和過表達后細胞的生物學行為改變進行研究,檢測YAP1在卵巢癌中是否起到促進腫瘤增殖的作用。MTT實驗檢測YAP1是否調(diào)節(jié)卵巢癌細胞系對CDDP的敏感性。最后通過實時定量PCR實驗對YAP1下游靶基因進行初步篩選。研究結(jié)果1.YAPl核表達水平與卵巢癌預后的關(guān)系為探究卵巢癌中YAP1表達水平與預后的關(guān)系,我們對76例卵巢癌石蠟組織切片進行免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn)YAP1在胞漿和胞核中均有表達,根據(jù)YAP1核表達水平分為YAP1核高表達和YAP1核低表達組,根據(jù)YAP1胞漿表達水平分為YAP1胞漿高表達和YAP1胞漿低表達組,并分別進行生存分析。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明,YAP1核高表達組與YAP1核低表達組相比其預后明顯較差(P=0.0163),而YAP1在胞漿中的表達則與預后無關(guān)(P=0.7143)。將YAP1在胞漿與胞核中的表達結(jié)合起來,對卵巢癌預后有較好的預測作用(P=0.0001)。2.YAP1在卵巢癌組織及細胞系中的蛋白表達水平檢測通過免疫組化和Western Blot方法,檢測YAP1在正常輸卵管傘組織和卵巢癌組織中蛋白表達水平。結(jié)果顯示YAP1在卵巢癌中的表達較正常輸卵管傘組織明顯升高。Western Blot檢測YAP1在卵巢癌細胞系及正常細胞系中的表達發(fā)現(xiàn),YAP1在卵巢癌細胞系中的表達顯著高于永生化的正常輸卵管細胞系(FTE187)。3.YAP1干擾及過表達細胞系的構(gòu)建我們成功構(gòu)建了YAP1的干擾載體pLKO.1-shYAP1和過表達載體pBABE-YAP1,結(jié)合YAP1在不同卵巢癌細胞系中的蛋白表達水平,選取YAP1表達水平較高的H08910和HEY細胞系進行干擾,選取YAP1低表達細胞系A(chǔ)2780和SKOV3進行過表達。通過細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定篩選的方法,獲得YAP1干擾及過表達的卵巢癌細胞系。4.YAP1增強卵巢癌細胞系的增殖能力利用增殖相關(guān)實驗檢測YAPl干擾及過表達后對細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)YAP1干擾細胞系shYAP1-HO8910和shYAP1-HEY的增殖能力明顯降低,而過表達細胞系YAP1-OVE-A2780和YAP1-OVE-SKOV3的增殖能力則顯著增強,證明YAP1在卵巢癌中具有促進腫瘤增殖的能力。5.YAP1降低卵巢癌細胞系對CDDP的藥物敏感性通過MTT法檢測YAP1過表達細胞系與對照細胞系對CDDP藥物敏感性的差別,結(jié)果顯示與對照組細胞相比,YAP1過表達細胞系對CDDP藥物敏感性降低。Western Blot檢測相關(guān)通路分子,結(jié)果提示YAP1對CDDP藥物敏感性的影響可能與pJNK的上調(diào)和pATF2的下調(diào)有關(guān)。6.YAP1下游靶基因篩選通過調(diào)控YAP1的表達情況,用實時定量PCR方法檢測YAP1潛在下游靶基因,最終篩選出ATF2、RAD51AP1和MYCL1等基因在多個細胞系中的表達與YAP1具有相關(guān)性,提示其可能為YAP1的下游靶基因。結(jié)論1.YAP1在卵巢癌中高表達,其核蛋白表達水平與卵巢癌預后相關(guān),YAP1核表達高提示預后差；YAP1促進卵巢癌細胞的增殖；YAP1增強卵巢癌細胞對CDDP的化療耐藥。2.ATF2、RAD51AP1和MYCL1可能是YAP1下游的靶基因。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

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本文編號：2744346