【摘要】：近年來,病毒載體憑借其利用病毒傳送基因組進(jìn)入其他細(xì)胞,從而進(jìn)行感染的分子機(jī)制,被廣泛應(yīng)用于基因治療和疫苗的開發(fā)中。因此圍繞病毒載體的優(yōu)化與改造已成為相關(guān)治療手段研發(fā)的重點(diǎn)。其中,病毒的重組構(gòu)建技術(shù)及其內(nèi)化入胞能力是其進(jìn)一步開發(fā)成為病毒載體的兩個(gè)關(guān)鍵研究方向。目前,胰腺癌已被列為十大惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在逐年遞增,但對(duì)其的治療方法及效果還尚無有效的措施來應(yīng)對(duì),因此常常被稱作“癌中之王”。隨著對(duì)癌癥的深入研究,基因治療和細(xì)胞治療已成為有效的新型療法。因此,本研究重組構(gòu)建了腺病毒和痘病毒,并分別對(duì)其胰腺癌抑制能力和毒力進(jìn)行了評(píng)價(jià);然后結(jié)合兩種病毒的自身尺寸大小及細(xì)胞內(nèi)吞方式,對(duì)兩種病毒的內(nèi)化入胞能力進(jìn)行分析,探討了兩種病毒進(jìn)一步開發(fā)成為病毒載體的潛力。第一,腺病毒作為一種溶瘤病毒具有一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力,且其可作為病毒載體來攜帶其他外源基因產(chǎn)生進(jìn)行進(jìn)一步的殺傷腫瘤的效應(yīng)。第二,痘病毒并不具備直接殺傷腫瘤的作用,但可作為病毒載體攜帶其他外源基因來殺傷腫瘤。第三,病毒入胞的模式由其顆粒大小、受體的選擇、宿主細(xì)胞趨向性以及傳播模式等決定。通常腺病毒的粒徑為70-90nm,而痘病毒較大,直徑可達(dá)300nm,研究病毒內(nèi)吞機(jī)制,其大小是一個(gè)重要指標(biāo)。但由于病毒其種屬偏好、高侵染性等特點(diǎn),目前難以使用病毒進(jìn)行廣泛地實(shí)驗(yàn)。本研究選用了一種尺寸靈活且可控、高度均一、強(qiáng)內(nèi)化能力的納米材料——介孔二氧化硅(MSNs)作為病毒內(nèi)吞研究的替代物,合成出不同尺寸的MSNs,并使用透射電鏡進(jìn)行尺寸驗(yàn)證,然后分別考察了不同尺寸(其尺寸大小依次為接近腺病毒的53nm、接近痘病毒的300nm和420nm)介孔二氧化硅的入胞情況,以確定腫瘤細(xì)胞巨胞飲能夠內(nèi)化物質(zhì)的尺寸范圍。由此初步推斷,腺病毒能通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞及巨胞飲等多種方式內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,而痘病毒僅能通過巨胞飲的方式入胞。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)重組腺病毒對(duì)胰腺癌具有較好的抑制作用;重組痘苗病毒在缺失兩段基因片段后,對(duì)細(xì)胞的毒力具有了顯著的下降,在細(xì)胞中病毒擴(kuò)散水平顯著降低;腺病毒能通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞及巨胞飲等多種方式內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,而痘病毒僅能通過巨胞飲的方式入胞。本研究的結(jié)果為腺病毒和痘病毒作為病毒載體的進(jìn)一步開發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐和設(shè)計(jì)參考。同時(shí),本研究使用納米材料代替病毒做巨胞飲的研究,加深了對(duì)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)吞大物質(zhì)機(jī)制的理解,也更好地了解病毒進(jìn)入胰腺癌細(xì)胞的過程,避免了使用病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的局限性,從而令殺傷效果較好的病毒載體的研究更加具有效率。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.9
【圖文】：

30圖 2.1 重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建圖2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) HyClone 公司；青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó) HyClone 公司；0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó) HyClone 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó) HyClone 公司；腺病毒大量純化試劑盒購(gòu)自美國(guó) Biomiga 公司；MTS 購(gòu)自美國(guó) Roche 公司；AO/EB 和DAPI 染料購(gòu)自美國(guó) Life 公司；恒溫 CO2 培養(yǎng)箱購(gòu)自日本松下公司；水平離心機(jī)購(gòu)自上海安亭公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京東聯(lián)公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó) Eppendorf 公司；熒光顯微鏡源自日本

24 h10 MOI 5.7±2.5 5.2±2.1 5.8±2.4 6.1±4.2100 MOI 6.2±3.7 6.5±3.4 6.6±3.1 6.1±2.748 h1 MOI 9.8±4.2 6.1±3.2 7.1±3.2 6.1±3.110 MOI 13.4±4.2 10.5±4.4 9.2±3.4 8.9±4.8100 MOI 20.3±3.2 16.5±5.6 12.7±2.8 8.5±4.272 h1 MOI 15.1±4.9 12.3±1.6 10.2±4.1 7.2±3.610 MOI 23.5±3.1 19.1±1.2 19.3±2.3 9.2±3.1100 MOI 40.7±3.7 35.5±3.4 31.6±2.6 9.7±2.396 h1 MOI 15.3±4.3 17.5±4.8 10.8±4.6 4.8±1.110 MOI 30.9±3.3 27.2±3.5 16.3±6.7 9.9±4.7100 MOI 45.6±3.3 39.1±2.1 15.2±3.9 6.2±3.4

圖 2.3 48h 重組腺病毒對(duì)人胰腺癌細(xì)胞 MIA-PaCa-2 存活率的影響圖 2.4 72h 重組腺病毒對(duì)人胰腺癌細(xì)胞 MIA-PaCa-2 存活率的影響

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