發(fā)布時間：2020-07-06 15:14

【摘要】：目的:1.探討circBIRC6在胃癌組織中的表達及對胃癌細胞功能的影響;2.揭示circBIRC6通過競爭性吸附miR-488進而激活GRIN2D基因在胃癌惡性表型中的作用機制;3.探討circBIRC6-miR-488-GRIN2D軸對胃癌自噬的影響;4.研究GRIN2D在胃癌中的表達及生物學功能,并分析其與胃癌臨床特征及預后的關系。方法:1.通過Hiseq平臺的第二代測序對6例胃癌新鮮樣本(設對照組)的基因全轉錄組進行高通量分析,尋找胃癌差異表達的基因;2.用30例胃癌組織(設對照組),經(jīng)實時熒光定量PCR檢測circBIRC6的表達水平;3.構建circBIRC6過表達載體及干擾質粒在細胞水平驗證circBIRC6在胃癌中的作用;4.生物信息學篩選circBIR6下游miRNA,用熒光原位雜交的方法檢測circBIRC6與候選miRNA在胃癌細胞中的定位情況;5.通過實時熒光定量PCR方法和RNA免疫共沉淀方法在胃癌細胞系中檢測circBIRC6對miR-488的影響;6.通過生物信息學分析miR-488的靶基因,并通過免疫印跡檢測其對靶基因蛋白水平的影響;7.通過雙熒光素酶報告實驗驗證miR-488與GRIN2D的結合位點;8.免疫組織化學法檢測胃癌組織及對照組織中GRIN2D的表達,統(tǒng)計分析其與臨床特征的相關性,并結合隨訪數(shù)據(jù)評估其預后價值;9.用過表達和crispr/cas9敲除技術在體外水平研究GRIN2D對GC發(fā)展的影響;10.挽救實驗驗證circBIRC6與miR-488及GRIN2D三者之間的調控關系以及對自噬的影響。結果:1.6對樣本二代測序結果顯示胃癌中差異mRNA共637個,其中269個為上調的mRNA,368個為下調mRNA;差異的miRNA共37個,23個為上調miRNA,14個為下調miRNA;差異circRNA共125個,57個為上調circRNA,68個為下調circRNA;2.circBIRC6在胃癌組織中表達高于配對良性切緣組織,(P0.001);3.胃癌細胞過表達circBIRC6后,胃癌細胞的增殖能力和侵襲遷移能力明顯增強;干擾circBIRC6后,胃癌細胞增殖能力和侵襲遷移能力明顯下降,凋亡增加;4.經(jīng)生物信息學分析,miR-488是circBIRC6的靶基因,通過熒光原位雜交實驗證實二者在細胞漿中存在共定位,RNA免疫共沉淀結果顯示circBIRC6、miR-488和AGO2可以形成三元復合物;5.過表達circBIRC6可以抑制miR-488的表達,反之,抑制circBIRC6后miR-488表達升高;6.生物信息學分析結果顯示GRIN2D的3’非翻譯區(qū)包含潛在的miR-488結合位點。熒光素酶報告載體實驗證實miR-488能夠通過作用于GRIN2D基因的3’非翻譯區(qū)對其表達進行負性調節(jié);7.免疫印跡結果表明miR-488能夠抑制GRIN2D的表達;8.挽救實驗證實miR-488通過下調GRIN2D在胃癌中發(fā)揮抑癌作用;9.用免疫組化法檢測胃癌組織中GRIN2D蛋白的表達情況,并分析GRIN2D的表達與胃癌臨床特征、預后的關系。結果:卡方分析結果顯示,胃癌組織中GRIN2D表達高于良性組織(χ~2=54.058,P0.001)。GRIN2D在胃癌組織中高表達與TNM分期晚有關,并具有明顯統(tǒng)計學意義(χ~2=24.496,P=0.002)。多因素生存分析結果顯示GRIN2D(P0.001,HR=2.383,95%CI為1.627-3.49),TNM分期(P0.001,HR=1.502,95%CI為1.366-1.652)和手術前CEA(P=0.017,HR=1.682,95%CI為1.098-2.574)是胃癌患者預后的獨立因素;10.在胃癌細胞中,過表達GRIN2D后,胃癌細胞的增殖能力和侵襲遷移能力明顯增強;敲除GRIN2D后,胃癌細胞的增殖能力和侵襲遷移能力明顯下降;11.過表達circBIRC6后,自噬相關蛋白Beclin-1蛋白和LC3蛋白B表達下調,P62蛋白表達上調。在挽救實驗中,過表達miR-488則能抑制circBIRC6對胃癌細胞的作用,但該抑制作用在過表達GRIN2D后被抵消。結論:1.circBIRC6競爭性結合miR-488,解除miR488對GRIN2D的抑制作用,從而促進GRIN2D的表達;2.circBIRC6-miR-488-GRIN2D軸通過影響自噬介導胃癌的惡性表型;3.GRIN2D在胃癌中高表達與TNM分期晚有關,是胃癌患者預后的獨立因素,體外功能學實驗顯示GRIN2D可介導胃癌的惡性表型。
【學位授予單位】：南通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

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1 李潔瑩;circBIRC6競爭性吸附miR-488調控GRIN2D影響自噬介導胃癌惡性表型的機制研究[D];南通大學;2018年

本文編號：2743809