【摘要】：目的:1.探討circBIRC6在胃癌組織中的表達(dá)及對(duì)胃癌細(xì)胞功能的影響;2.揭示circBIRC6通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-488進(jìn)而激活GRIN2D基因在胃癌惡性表型中的作用機(jī)制;3.探討circBIRC6-miR-488-GRIN2D軸對(duì)胃癌自噬的影響;4.研究GRIN2D在胃癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能,并分析其與胃癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。方法:1.通過(guò)Hiseq平臺(tái)的第二代測(cè)序?qū)?例胃癌新鮮樣本(設(shè)對(duì)照組)的基因全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量分析,尋找胃癌差異表達(dá)的基因;2.用30例胃癌組織(設(shè)對(duì)照組),經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)circBIRC6的表達(dá)水平;3.構(gòu)建circBIRC6過(guò)表達(dá)載體及干擾質(zhì)粒在細(xì)胞水平驗(yàn)證circBIRC6在胃癌中的作用;4.生物信息學(xué)篩選circBIR6下游miRNA,用熒光原位雜交的方法檢測(cè)circBIRC6與候選miRNA在胃癌細(xì)胞中的定位情況;5.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和RNA免疫共沉淀方法在胃癌細(xì)胞系中檢測(cè)circBIRC6對(duì)miR-488的影響;6.通過(guò)生物信息學(xué)分析miR-488的靶基因,并通過(guò)免疫印跡檢測(cè)其對(duì)靶基因蛋白水平的影響;7.通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-488與GRIN2D的結(jié)合位點(diǎn);8.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織及對(duì)照組織中GRIN2D的表達(dá),統(tǒng)計(jì)分析其與臨床特征的相關(guān)性,并結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)評(píng)估其預(yù)后價(jià)值;9.用過(guò)表達(dá)和crispr/cas9敲除技術(shù)在體外水平研究GRIN2D對(duì)GC發(fā)展的影響;10.挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circBIRC6與miR-488及GRIN2D三者之間的調(diào)控關(guān)系以及對(duì)自噬的影響。結(jié)果:1.6對(duì)樣本二代測(cè)序結(jié)果顯示胃癌中差異mRNA共637個(gè),其中269個(gè)為上調(diào)的mRNA,368個(gè)為下調(diào)mRNA;差異的miRNA共37個(gè),23個(gè)為上調(diào)miRNA,14個(gè)為下調(diào)miRNA;差異circRNA共125個(gè),57個(gè)為上調(diào)circRNA,68個(gè)為下調(diào)circRNA;2.circBIRC6在胃癌組織中表達(dá)高于配對(duì)良性切緣組織,(P0.001);3.胃癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)circBIRC6后,胃癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲遷移能力明顯增強(qiáng);干擾circBIRC6后,胃癌細(xì)胞增殖能力和侵襲遷移能力明顯下降,凋亡增加;4.經(jīng)生物信息學(xué)分析,miR-488是circBIRC6的靶基因,通過(guò)熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者在細(xì)胞漿中存在共定位,RNA免疫共沉淀結(jié)果顯示circBIRC6、miR-488和AGO2可以形成三元復(fù)合物;5.過(guò)表達(dá)circBIRC6可以抑制miR-488的表達(dá),反之,抑制circBIRC6后miR-488表達(dá)升高;6.生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示GRIN2D的3’非翻譯區(qū)包含潛在的miR-488結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-488能夠通過(guò)作用于GRIN2D基因的3’非翻譯區(qū)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié);7.免疫印跡結(jié)果表明miR-488能夠抑制GRIN2D的表達(dá);8.挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-488通過(guò)下調(diào)GRIN2D在胃癌中發(fā)揮抑癌作用;9.用免疫組化法檢測(cè)胃癌組織中GRIN2D蛋白的表達(dá)情況,并分析GRIN2D的表達(dá)與胃癌臨床特征、預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:卡方分析結(jié)果顯示,胃癌組織中GRIN2D表達(dá)高于良性組織(χ~2=54.058,P0.001)。GRIN2D在胃癌組織中高表達(dá)與TNM分期晚有關(guān),并具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ~2=24.496,P=0.002)。多因素生存分析結(jié)果顯示GRIN2D(P0.001,HR=2.383,95%CI為1.627-3.49),TNM分期(P0.001,HR=1.502,95%CI為1.366-1.652)和手術(shù)前CEA(P=0.017,HR=1.682,95%CI為1.098-2.574)是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素;10.在胃癌細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)GRIN2D后,胃癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲遷移能力明顯增強(qiáng);敲除GRIN2D后,胃癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲遷移能力明顯下降;11.過(guò)表達(dá)circBIRC6后,自噬相關(guān)蛋白Beclin-1蛋白和LC3蛋白B表達(dá)下調(diào),P62蛋白表達(dá)上調(diào)。在挽救實(shí)驗(yàn)中,過(guò)表達(dá)miR-488則能抑制circBIRC6對(duì)胃癌細(xì)胞的作用,但該抑制作用在過(guò)表達(dá)GRIN2D后被抵消。結(jié)論:1.circBIRC6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-488,解除miR488對(duì)GRIN2D的抑制作用,從而促進(jìn)GRIN2D的表達(dá);2.circBIRC6-miR-488-GRIN2D軸通過(guò)影響自噬介導(dǎo)胃癌的惡性表型;3.GRIN2D在胃癌中高表達(dá)與TNM分期晚有關(guān),是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素,體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示GRIN2D可介導(dǎo)胃癌的惡性表型。
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

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1 李潔瑩;circBIRC6競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-488調(diào)控GRIN2D影響自噬介導(dǎo)胃癌惡性表型的機(jī)制研究[D];南通大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2743809