【摘要】：目的:腸道粘膜免疫系統(tǒng)作為全身免疫系統(tǒng)的重要組成部分,深刻影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過口服腫瘤疫苗的模式重塑腸道粘膜免疫,進(jìn)而誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗腫瘤免疫保護(hù)作用,這可能是一種全新的腫瘤免疫途徑。腫瘤細(xì)胞來源的微顆粒(tumor cell-derived microparticles,T-MPs)是當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到外界刺激或發(fā)生凋亡時(shí),通過改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)而向胞外釋放的一類直徑位于100到1OOOnm之間、由細(xì)胞膜包裹細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的囊性小泡。我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)T-MPs同時(shí)攜帶有腫瘤抗原和DNA等固有免疫信號(hào)分子,其特有的脂筏結(jié)構(gòu)具有極好的理化穩(wěn)定性,且將T-MPs作為疫苗進(jìn)行皮下免疫獲得了理想的效果。在此基礎(chǔ)上,本研究將T-MPs作為口服疫苗,深入探索T-MPs介導(dǎo)的腸道粘膜免疫系統(tǒng)的改變,闡明腸道抗腫瘤免疫應(yīng)答的相關(guān)機(jī)制,為開發(fā)新型口服腫瘤疫苗提供可能。方法:(1)為了證明口服T-MPs能體內(nèi)抑制腫瘤生長,我們分別提取B16-MPs和CT-26-MPs 口服免疫小鼠,再皮下接種相應(yīng)腫瘤細(xì)胞,繪制腫瘤生長曲線;為了證明口服T-MPs引起的免疫反應(yīng)具有抗原特異性,我們用OVAB16-MPs、B16-MPs和Ovalbumin 口服免疫小鼠,再皮下接種OVAB16細(xì)胞;為證明T-MPs比腫瘤細(xì)胞裂解物和凋亡腫瘤細(xì)胞更具優(yōu)勢(shì),我們用B16-MPs、B16細(xì)胞裂解物和凋亡B16細(xì)胞口服免疫小鼠,再皮下接種B16細(xì)胞;用B16-MPs 口服免疫裸鼠研究T-MPs介導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型。(2)為了探索口服T-MPs是否能介導(dǎo)腸道局部和全身性T細(xì)胞免疫應(yīng)答,我們用B16-MPs 口服免疫小鼠,使用流式細(xì)胞染色檢測(cè)脾臟和腸系膜淋巴結(jié)(MLN)IFN-γ+的CD8+和CD4+T細(xì)胞比例以及其他CD4+ T細(xì)胞亞群的比例,使用qPCR檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá);利用口服免疫OVAB16-MPs再分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外二次刺激的方式,流式檢測(cè)IFN-γ的產(chǎn)生,證明T-MPs可在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞。(3)建立小鼠體內(nèi)DCs條件性清除和重建模型,通過流式檢測(cè)IFN-γ+的CD8+和CD4+T細(xì)胞比例判斷T-MPs誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫是否被啟動(dòng),研究DCs是否參與T-MPs介導(dǎo)的抗腫瘤T細(xì)胞免疫。(4)為了研究T-MPs在腸道的攝取情況,給小鼠口服PKH26-T-MPs,于多個(gè)時(shí)間點(diǎn)流式檢測(cè)不同腸段細(xì)胞對(duì)T-MPs的攝取情況;將腸道細(xì)胞分為CD45+免疫細(xì)胞和CD45-非免疫細(xì)胞兩類,使用流式和免疫熒光的方法檢測(cè)PKH26-T-MPs被何種細(xì)胞攝取;利用細(xì)胞骨架抑制劑秋水仙堿研究腸上皮細(xì)胞(IECs)對(duì)T-MPs的轉(zhuǎn)吞作用。(5)先給小鼠口服H22-MPs,再用流式和免疫熒光的方法檢測(cè)腸道CD11c+,CD103+以及CD3+CD8+細(xì)胞的比例,研究T-MPs對(duì)腸道免疫細(xì)胞的動(dòng)員情況;同時(shí)用qPCR和ELISA從基因和蛋白水平檢測(cè)IECs趨化因子的表達(dá),研究腸道免疫細(xì)胞的遷移是否與趨化因子有關(guān)。(6)為探索IECs產(chǎn)生趨化因子的信號(hào)傳導(dǎo)問題,我們使用Western blot和免疫熒光的方法檢測(cè)攝取了 H22-MPs的IECs內(nèi)MAPK和NF-κB的活化情況,并利用MAPK和NF-κB抑制劑反向證明;為進(jìn)一步研究MAPK和NF-κB信號(hào)的上游分子,我們通過qPCR和Western blot檢測(cè)攝取了 H22-MPs的IECs內(nèi)NOD受體的表達(dá),并用基因敲除鼠再次檢測(cè)MAPK和NF-κB的活化、趨化因子的表達(dá)、免疫細(xì)胞的募集和口服T-MPs的腫瘤生長抑制作用。結(jié)果:(1)將B16-MPs和CT-26-MPs分別口服免疫小鼠,再皮下接種相應(yīng)腫瘤細(xì)胞,結(jié)果B16-MPs和CT-26-MPs在不同品系的小鼠都有很好的腫瘤生長抑制作用;口服免疫OVAB16-MPs比B16-MPs和Ovalbumin有更顯著的抗OVAB16腫瘤作用;口服免疫B16-MPs比相應(yīng)細(xì)胞裂解物和凋亡細(xì)胞能更有效地抑制B16腫瘤的生長;口服B16-MPs在裸鼠體內(nèi)不能抑制腫瘤生長。(2)用B16-MPs 口服免疫小鼠后,發(fā)現(xiàn)MLN和脾臟分泌IFN-γ的CD8+和CD4+ T細(xì)胞比例增加,而CD4+ T細(xì)胞其他亞群的比例沒有改變,且Th1相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào);分離口服OVAB16-MPs、B16-MPs和Ovalbumin小鼠的淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外OVA肽二次刺激時(shí),OVAB16-MPs組可產(chǎn)生更多IFN-γ。(3)用DT清除CD11c-DTR小鼠的DCs,再通過額外DCs的過繼進(jìn)行重建,結(jié)果顯示DCs的清除不改變IFN-γ+ T細(xì)胞的比例,而DCs的重建恢復(fù)了 T-MPs誘導(dǎo)的IFN-γ+T細(xì)胞的比例增加。(4)給小鼠灌胃PKH26-T-MPs,發(fā)現(xiàn)T-MPs在1h被回腸攝取最多,且攝取了 T-MPs的細(xì)胞主要是IECs,而CD11c+CD103+DCs只攝取少部分;使用秋水仙堿抑制IECs的轉(zhuǎn)吞作用,發(fā)現(xiàn)DCs獲取的T-MPs是由IECs釋放而來。(5)小鼠口服H22-MPs后,發(fā)現(xiàn)回腸細(xì)胞中CD11c+,CD103+以及CD3+CD8+細(xì)胞的比例增加;同時(shí)回腸IECs會(huì)在基因和蛋白水平上調(diào)表達(dá)趨化因子CCL2,CCL20和CX3CL1,其中CCL2上調(diào)程度顯著且維持時(shí)間最長。(6)發(fā)現(xiàn)攝取了 T-MPs的IECs胞內(nèi)的ERK和p38的磷酸化水平增加,NF-κB入核,使用抑制劑能阻斷CCL2的上調(diào)表達(dá);攝取了 T-MPs的IECs胞內(nèi)的NOD2受體在基因和蛋白水平均上調(diào)表達(dá),在NOD2敲除小鼠體內(nèi),MAPK和NF-κB的活化、CCL2的表達(dá)增加、CD103+DCs和CD8+T細(xì)胞的遷移募集以及口服T-MPs抑制腫瘤生長的現(xiàn)象均被阻斷。結(jié)論:T-MPs經(jīng)口服途徑到達(dá)腸道后,大部分能夠被回腸上皮細(xì)胞攝取,一方面,T-MPs與IECs胞內(nèi)的NOD2受體作用,活化下游的MAPK和NF-κB信號(hào),導(dǎo)致以CCL2為主的趨化因子的上調(diào)表達(dá)和釋放,進(jìn)而募集CD103+DCs;另一方面,T-MPs被IECs經(jīng)轉(zhuǎn)吞作用從腸腔面轉(zhuǎn)運(yùn)到基底面,從而被遷移來的CD103+DCs捕獲并抗原提呈,引發(fā)腸道粘膜局部和全身系統(tǒng)性抗腫瘤T細(xì)胞免疫應(yīng)答。T-MPs作為腫瘤口服疫苗不僅具有有效性和廣譜性,且比其他腫瘤疫苗成分具有更大優(yōu)勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.51
【圖文】：

再給所有組小鼠皮下接種Ｂ１６腫瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，與ＰＢＳ對(duì)照組相比，只有逡逑口服免疫Ｂ１６－ＭＰＳ能顯著抑制Ｂ１６腫瘤生長，而口服免疫Ｂ１６細(xì)胞裂解物和逡逑凋亡Ｂ１６細(xì)胞卻沒有抗腫瘤效果（圖３）。這說明口服Ｔ－ＭＰｓ比口服其他腫瘤疫逡逑苗成分能介導(dǎo)更強(qiáng)大的免疫保護(hù)作用，暗示了通過口服途徑，Ｔ－ＭＰｓ比其他腫逡逑瘤疫苗成分具有更大優(yōu)勢(shì)。逡逑３６逡逑

再給所有組小鼠皮下接種Ｂ１６腫瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，與ＰＢＳ對(duì)照組逡逑相比，口服Ｂ１６－ＭＰＳ并不能介導(dǎo)與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的抗腫瘤免疫效應(yīng)，對(duì)Ｂ１６逡逑腫瘤的生長無抑制作用（圖４）。這說明當(dāng)小鼠體內(nèi)沒有Ｔ細(xì)胞時(shí)，口服Ｔ－ＭＰｓ逡逑的抗腫瘤效應(yīng)便不能發(fā)揮，暗示了口服Ｔ－ＭＰｓ疫苗介導(dǎo)的免疫保護(hù)作用是Ｔ細(xì)逡逑胞依賴的。逡逑３７逡逑

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本文編號(hào)：2742102