發(fā)布時間：2020-07-03 15:56

【摘要】：納米技術(shù)在腫瘤治療和成像方面展現(xiàn)出廣闊的應用前景。合理利用腫瘤微環(huán)境特征,開發(fā)智能化納米藥物遞送系統(tǒng),是提高治療效果、放大成像信號及減少毒副作用的重要途徑之一。近年來,光動力以及光熱治療在腫瘤治療中被廣泛關注。增加腫瘤病灶的氧供給以及掃除活性氧發(fā)揮作用的障礙是光動力治療亟待解決的難題之一。對于光動力治療和光熱治療的聯(lián)合應用,揭示活性氧及熱效應共同作用引起細胞死亡的機制是尋找有效的聯(lián)合治療手段的前提。本研究,基于二氧化錳包覆的聚乳酸羥基乙酸共聚物納米粒和無定型介孔磷酸錳納米材料,設計并構(gòu)建了三種腫瘤微環(huán)境響應式治療成像系統(tǒng)。三種系統(tǒng)分別基于二氧化錳促進“開源節(jié)流”式生成活性氧的功能、吖啶黃對光動力治療逃逸途徑中低氧誘導因子1-α/血管內(nèi)皮生長因子(HIF-1α/VEGF)信號通路的抑制作用以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑雷帕霉素的多機制抗腫瘤作用,以增強各系統(tǒng)在激光照射下的光動力治療及其與光熱治療的聯(lián)合作用。此外,三種系統(tǒng)還具有腫瘤微環(huán)境刺激響應的磁共振成像信號放大和治療藥物釋放的特性。主要內(nèi)容如下:1.“開源節(jié)流”式光動力治療體系用于增強腫瘤光動力治療和磁共振成像研究光動力治療是一種非侵入性的治療方式,依賴于光敏劑、氧氣以及激光刺激。除了借助納米靶向技術(shù)增加光敏劑在腫瘤部位的蓄積外,利用納米材料與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用,改善腫瘤氧供給,降低大量耗竭活性氧的還原型谷胱甘肽的水平,進而掃除活性氧發(fā)揮作用的障礙,實現(xiàn)“開源節(jié)流”式活性氧(ROS)蓄積,對于增強腫瘤光動力治療具有重要價值。本課題構(gòu)建了一種二氧化錳納米層覆蓋的聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)納米粒,用于增強腫瘤光動力治療和磁共振成像。首先,制備載光敏劑血卟啉單甲醚(HMME)的PLGA納米粒(PLGA/HMME),然后將高錳酸鉀還原為二氧化錳覆蓋于載光敏劑納米粒上,形成PLGA/HMME@MnO2納米粒。該二氧化錳覆蓋層能夠催化腫瘤微環(huán)境中的H202生成氧氣,有利于HMME在激光下生成更多活性氧,而且二氧化錳可以耗竭還原型谷胱甘肽(GSH),降低活性氧的消耗,實現(xiàn)ROS的“開源節(jié)流”,助力腫瘤光動力治療。制劑表征顯示納米粒平均粒徑約為209.8 nm,平均zeta電位為-4.4 mV,穩(wěn)定性良好。光敏劑包載于PLGA后,單線態(tài)氧的產(chǎn)生能力不受影響,光敏劑包封率為75.0%。體外釋放結(jié)果表明,在含谷胱甘肽釋放介質(zhì)中,PLGA/HMME@MnO2在12h的累計釋放量為82.0%,而在無谷胱甘肽釋放介質(zhì)中,累計釋放量為56.9%。因此,納米粒表面的二氧化錳納米層能夠減緩HMME釋放。通過流式細胞儀定量分析細胞內(nèi)的ROS含量。HMME + 532 nm激光組、PLGA/HMME + 532 nm激光組和PLGA/HMME@MnO2 + 532 nm激光組的陽性細胞百分數(shù)分別為14.9%、27.5%和 35.8%。與空白組相比,PLGA/HMME@Mn02作用 24 h后,細胞內(nèi)GSH水平有所下降。因此,二氧化錳的包覆在ROS的“開源節(jié)流”中發(fā)揮了關鍵性作用。體內(nèi)藥物動力學研究表明,PLGA/HMME@Mn02納米制劑的AUC值為115.26 μg/(mL·h),t1/2為15.29 h,說明該系統(tǒng)具有體內(nèi)長循環(huán)的效果。藥效學實驗表明,PLGA/HMME@MnO2+ 532 nm激光組荷瘤小鼠的相對腫瘤體積為1.5±0.4,與HMME + 532 nm激光組,PLGA/HMME + 532 nm激光組有顯著性差異。哌莫硝唑探針檢測腫瘤組織的乏氧情況,結(jié)果證實二氧化錳能夠改善腫瘤乏氧環(huán)境。體內(nèi)外的磁共振成像結(jié)果顯示,在模擬腫瘤微環(huán)境及腫瘤微環(huán)境中,PLGA/HMME@Mn02在0.5 T磁場下的弛豫率大于1.0 mM-1 s-1,能夠增強T1加權(quán)成像效果。綜上所述,該無機有機納米雜化系統(tǒng)為增強腫瘤光動力治療和磁共振成像提供了一種新途徑。2.pH超敏感介孔磷酸錳納米粒用于級聯(lián)式光動力治療與磁共振成像研究光動力治療引起的氧耗竭會加重腫瘤的乏氧環(huán)境,導致光動力治療抵抗或者逃逸。低氧誘導因子1α/血管內(nèi)皮生長因子(HIF-1α/VEGF)信號通路激活與腫瘤乏氧引起的治療抵抗密切相關。我們通過一步溶劑水熱法制備了無定型的介孔磷酸錳(PMP)納米粒。由于其具有無定型特征,PMP對pH具有超敏感響應崩解特性,可以實現(xiàn)藥物控釋,更為重要的是,PMP降解后的錳離子可以增強磁共振成像。PMP的介孔結(jié)構(gòu)有利于光敏劑二氫卟吩(Ce6)和HIF-1α/VEGF信號通路抑制劑吖啶黃(ACF)共包載。通過pH敏感鍵苯硼酸酯將羧甲基葡聚糖覆蓋在納米粒的表面,形成C-PMP/Ce6/ACF系統(tǒng)。該系統(tǒng)不但可以減少所裝載藥物在血液循環(huán)過程中的泄漏,而且可以實現(xiàn)腫瘤間質(zhì)微環(huán)境刺激響應的苯硼酸功能基團暴露,利于納米粒和腫瘤細胞表面的唾液酸結(jié)合,促進藥物轉(zhuǎn)運入胞。通過3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)的氨基化修飾,脂溶性的磷酸錳納米粒成功的轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘募{米粒。研究結(jié)果表明,C-PMP/Ce6/ACF納米粒大小均勻,平均粒徑約180.7 nm,多分散指數(shù)(PDI)約0.21,平均zeta電位約-22.6 mV,說明穩(wěn)定性良好。體外釋放結(jié)果顯示,在pH 7.4 PBS中,C-PMP/Ce6/ACF在24 h內(nèi)累計釋放ACF和Ce6的百分數(shù)分別為60.89%和52.70%。在pH6.0PBS中,(C-PMP/Ce6/ACF在24h內(nèi)累計釋放ACF和Ce6的百分數(shù)分別為89.84%和96.87%。因此,該系統(tǒng)具有明顯的pH響應釋放特征。C-PMP/Ce6/ACF在pH 7.4和6.0條件下的r1弛豫率分別為1.9 mM-1 s-1和4.8 mM-1 s-1。細胞凋亡實驗表明,在660 nm激光作用下,C-PMP/Ce6/ACF對SMMC-7721腫瘤細胞具有明顯的生長抑制作用,可誘導細胞產(chǎn)生大量的ROS,促進細胞凋亡,聯(lián)合治療組細胞凋亡率高達92.4%。通過qPCR和ELISA實驗,也證實了 ACF能夠下調(diào)VEGF mRNA和VEGF的表達。體內(nèi)實驗表明,C-PMP/Ce6和C-PMP/Ce6/ACF組相對腫瘤體積在660 nm激光照射下均表現(xiàn)出相對減小的趨勢,相對腫瘤體積分別為3.7 ± 0.4和2.7 ± 0.3。磁共振成像結(jié)果顯示,荷瘤小鼠注射C-PMP/Ce6/ACF制劑后,從冠狀面和橫斷面能夠看到腫瘤部位明顯白化,和正常組織的區(qū)分度明顯�？傊�,C-PMP/Ce6/ACF納米粒在增強光動力治療效果,克服治療逃逸以及腫瘤微環(huán)境激活式MRI方面展現(xiàn)了優(yōu)良性質(zhì)。3.共載雷帕霉素和吲哚菁綠的介孔磷酸錳納米粒用于腫瘤多機制聯(lián)合治療研究鑒于吲哚菁綠(ICG)在激光照射下產(chǎn)生的活性氧(ROS)和熱效應引起的自噬潛力,以增加自噬水平為目標的治療方式和ICG光療聯(lián)合具有增強腫瘤治療效果的潛力。mTOR特異性抑制劑雷帕霉素(RAPA),不但能夠降低腫瘤細胞HIF-1α的表達,進而降低VEGF的表達,而且能夠促進自噬。ICG水溶液的不穩(wěn)定性及注射到體內(nèi)容易在體內(nèi)快速消除等缺陷限制了其應用。同時,雷帕霉素在水中的溶解度也較低。尋找載藥能力強的載體是提高藥物穩(wěn)定性、實現(xiàn)兩者聯(lián)用的有效途徑。本課題將集載藥能力高、微酸性響應控釋特性與磁共振成像信號放大功能于一體的介孔磷酸錳納米粒作為RAPA和ICG轉(zhuǎn)運載體,以期實現(xiàn)多機制腫瘤綜合治療。將納米粒表面化學修飾聚谷氨酸(PGA),不但提高了載藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性,而且能夠?qū)崿F(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶介導下的內(nèi)吞入胞。對于MCF-7腫瘤細胞,ICG光療產(chǎn)生的ROS和熱效應誘導顯著的自噬性細胞死亡以及細胞凋亡,而RAPA發(fā)揮mTOR抑制作用,促進自噬發(fā)生及HIF-1α/VEGF信號通路抑制,最終兩者通過多機制作用抑制腫瘤生長。制劑表征表明,系統(tǒng)中ICG和RAPA的包封率分別44.3%和44.0%。由于ICG包封于介孔磷酸錳的孔隙中,并且以無定型狀態(tài)存在,不但穩(wěn)定性明顯改善,而且光熱轉(zhuǎn)換效率也有所提升。在相同濃度下,激光照射3.5 min,PGA/PMP/RAPA/ICG的溫度升高了 18.1 ℃,ICG的溫度升高了 10.0 ℃。蛋白印跡檢測表明,ICG光療和RAPA均能促進自噬標記物LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變。自噬熒光融合蛋白mCherry-EGFP-LC3示蹤、及細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察和qPCR結(jié)果表明,光療和RAPA聯(lián)用促進細胞自噬和凋亡發(fā)生,進一步揭示了光療引起MCF-7內(nèi)ROS蓄積,線粒體膜電位下降等變化,最終通過自噬性細胞死亡、細胞凋亡和抑制HIF-1α/VEGF信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。動物實驗表明,808 nm激光照射注射PGA/PMP/ICG/RAPA的荷瘤小鼠腫瘤部位,照射1.5min,腫瘤部位溫度從35.1 ℃增加到43.2 ℃。PGA/PMP/ICG/RAPA激光組小鼠的腫瘤體積明顯減小,相對腫瘤體積為1.8 ± 0.4。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,與單純光療組相比,PGA/PMP/ICG/RAPA系統(tǒng)下調(diào)了腫瘤組織HIF-1α的表達,降低了VEGF的表達量,抑制腫瘤血管生成作用明顯�？傊�,該光療及mTOR抑制劑RAPA聯(lián)合治療系統(tǒng)在提高藥物穩(wěn)定性和腫瘤多機制聯(lián)合治療方面優(yōu)勢明顯。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.5
【圖文】：

近紅外光對腫瘤組織的穿透能力強，近紅外光吸收光熱轉(zhuǎn)換劑光熱治療的基礎研宄。迄今為止，這些有機／無機近紅外光吸收光但不局限于以下幾類：（１）金納米材料：金納米棒［１８］，金納米星［２（）］，金納米殼［２１］；邋（２）碳基納米材料：碳納米管［２２］，碳點［２３］；邋（３料：鈀納米片［２４］，鈀納米粒等［２５］；邋（４）金屬硫化物納米粒：硫］，硫化鉬［２８］，硫化亞鐵［２９］等；（５）金屬氧化物納米粒：氧化鉬［３Ｇ］；邋（６）近紅外吸收有機染料：吲哚菁綠［３２］，ＩＲ７８０［３３］，ＩＲ８２５［３４］米粒：聚吡咯納米粒［３５］，聚苯胺納米粒［３６］；邋（８）其它類：黑磷士藍納米粒［３８］等。逡逑來說，在激光照射下，這些光熱轉(zhuǎn)化劑在體內(nèi)外顯示出對惡性腫力。然而，光熱治療通常會引起熱休克蛋白表達的上調(diào)，進而耐受性，削弱了熱療效果［３９］。為了達到低劑量光熱轉(zhuǎn)化劑在低功的優(yōu)異光熱治療效果，設計構(gòu)建光熱轉(zhuǎn)化效率高的材料以及探宄白表達的新策略對于光熱腫瘤治療的應用至關重要［４Ｑ１。逡逑

胞外液和體循環(huán)的水平［７＜）］。由于腫瘤的異常代謝，腫瘤細胞內(nèi)含有較高濃度的逡逑還原型ＧＳＨ，其還原型谷胱甘肽的濃度是正常細胞的７－１０倍［７１］。歸納起來，逡逑腫瘤部位谷胱甘肽濃度差異如圖１．４所示。逡逑＊邋Ｖ邐逡逑＾＿ｉ￣￣逡逑—ＷＢＨＶ逡逑ｔ邋ｎ邋．邐＾逡逑Ｊ邋ｊ逡逑．：？．」邐逡逑、：＇．：、邐＇邐Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ＧＳＨ邋ｌｅｖｅｌ：逡逑Ｎｏｒｍａｌ邋ｃｅｌｌ邐＂邐■邐２－２０邋ｐＭ邐＾逡逑圖１．４腫瘤部位谷胱甘肽濃度差異示意圖逡逑還原響應性藥物遞釋系統(tǒng)用于藥物控釋的例子不勝枚舉［７２］。其中，最為常逡逑見的為基于二硫鍵連接的兩親性嵌段共聚物通過自組裝形成的載藥納米膠束。逡逑Ｙａｎｇ等人合成了通過分子內(nèi)氫鍵和二硫鍵形成的聚乙二醇一聚乳酸（ＰＥＧ－ＰＬＡ）逡逑聚合物，實現(xiàn)了腫瘤細胞內(nèi)高ＧＳＨ響應的阿霉素釋放［７３］。此外，Ｚｈａｎｇ等將喜逡逑樹堿（ＣＰＴ）通過二硫鍵連接在具有白蛋白結(jié)合能力的依文思藍（ＥＢ）衍生物逡逑上，該喜樹堿前藥（ＣＰＴ－Ｓ－Ｓ－ＥＢ）可以在水溶液中自組裝成８０ｎｍ的納米粒［７４］。逡逑注射進入生物體內(nèi)后，納米�？梢钥焖俎D(zhuǎn)變?yōu)椋峰澹睿戆椎鞍祝茫校郧八幖{米粒。逡逑納米粒進而能夠被高效的攝入細胞內(nèi)，進而在腫瘤細胞內(nèi)較高ＧＳＨ的條件下釋逡逑放藥物。在小鼠體內(nèi)，納米粒長循環(huán)特性優(yōu)異；此外，在腫瘤部位的蓄積量也逡逑是ＣＰＴ的約３０倍。除了利用二硫鍵形成聚合物用于構(gòu)建納米粒，還有研究利逡逑用該原理用于制備復合多功能納米粒載藥系統(tǒng)。Ｒａｊｅｎｄｒａ等人將綠色熒光碳點逡逑作為蓋帽劑通過二硫鍵連接在二氧化硅納米粒表面

本文編號：2739872