【摘要】：目的膀胱癌(Bladdercancer)是我國(guó)發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,也是全身十大最常見(jiàn)腫瘤之一。世界范圍內(nèi)膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位,在男性排名第四位,女性排在第十一位。部分膀胱癌患者在初診或者治療過(guò)程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移無(wú)法進(jìn)行根治性手術(shù)只能進(jìn)行姑息性化療。以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案GC方案(吉西他濱+順鉑)和MAVC方案(甲氨蝶呤+阿霉素+長(zhǎng)春新堿+順鉑)為目前一線的膀胱癌化療方案,遺憾的是這些以順鉑為代表的化療方案雖然在一定程度上能延長(zhǎng)患者的生存期,但是總體的預(yù)后依舊很差,有效率僅約為35%-60%,其中一個(gè)重要的原因是膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生了一定程度的耐藥性。目前認(rèn)為藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要的機(jī)制,而多藥耐藥相關(guān)基因MDR1所編碼表達(dá)的P-gp能發(fā)揮將藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)功能。Bmi-1是一種原癌基因,已經(jīng)被報(bào)道與多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展都有緊密的關(guān)系。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)對(duì)化療不敏感的膀胱癌患者的腫瘤組織中Bmi-1的表達(dá)明顯高于對(duì)化療敏感的膀胱癌患者的腫瘤組織,這提示Bmi-1可能與膀胱癌的耐藥有著密切的關(guān)系。那么膀胱癌中Bmi-1的表達(dá)是否會(huì)影響MDR1所編碼的P-gp的表達(dá)從而影響膀胱癌細(xì)胞對(duì)于順鉑的耐藥性目前仍不清楚。所以,我們將探究Bmi-1對(duì)于膀胱癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響并探究其機(jī)制。方法1.膀胱癌順鉑與吉西他濱耐藥細(xì)胞系的建立及生物學(xué)特征分析(1)采用濃度交替遞增法以較低濃度順鉑處理親本膀胱癌細(xì)胞T24,待其恢復(fù)后改用較低濃度的吉西他濱處理,之后逐步交替提高處理的順鉑和吉西他濱濃度直到細(xì)胞能在含有一定濃度的順鉑(DDP)或者吉西他濱(GEM)的培養(yǎng)液中穩(wěn)定的生長(zhǎng)傳代。(2)利用Western-blot技術(shù)檢測(cè)T24與T24/DDPGEM中的P-gp的表達(dá)。(3)利用CCK-8法測(cè)定T24與T24/DDPGEM對(duì)于順鉑和吉西他濱的半數(shù)抑制濃度并計(jì)算耐藥指數(shù)RI。(4)于倒置相差顯微鏡下觀察T24與T24/DDPGEM的形態(tài)。(5)應(yīng)用CCK-8法繪制T24與T24/DDPGEM的生長(zhǎng)曲線并計(jì)算倍增時(shí)間。(6)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T24與T24/DDPGEM的細(xì)胞周期比例。(7)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T24/DDPGEM與T24對(duì)于順鉑和吉西他濱耐藥性的差異。(8)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T24/DDPGEM與T24對(duì)于順鉑和吉西他濱耐藥性的差異。2.Bmi-1在耐藥膀胱癌中的表達(dá)及對(duì)膀胱癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響(1)應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)臨床上對(duì)化療敏感與不敏感的患者的腫瘤組織中Bmi-1的表達(dá)。應(yīng)用Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌耐藥細(xì)胞T24/DDPGEM與T24細(xì)胞中Bmi-1的表達(dá)。(2)在膀胱癌細(xì)胞中干擾和過(guò)表達(dá)Bmi-1。(3)利用CCK-8法檢測(cè)Bmi-1對(duì)于順鉑耐藥性的影響。(4)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在膀胱癌耐藥細(xì)胞中敲除Bmi-1后,利用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定順鉑耐藥細(xì)胞Bmi-1基因敲除后對(duì)于順鉑耐藥性的變化。3.Bmi-1影響膀胱癌細(xì)胞順鉑的耐藥性的機(jī)制(1)干擾和過(guò)表達(dá)Bmi-1的表達(dá)后檢測(cè)P-gp的表達(dá)。(2)利用Rodamin123檢測(cè)膀胱癌耐藥細(xì)胞的Bmi-1基因敲除后藥物轉(zhuǎn)運(yùn)能力的變化。4.Bmi-1影響P-gp表達(dá)的可能的機(jī)制(1)miRNA 芯片(2)差異miRNA分析(3)Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)(4)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證Bmi-1與hsa-miRNA-3682-3p的關(guān)系(5)雙因素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證hsa-miRNA-3682-3p能與P-gp的mRNA的3' UTR直接結(jié)合5.Bmi-1對(duì)于膀胱癌化療后的臨床意義(1)Bmi-1與膀胱癌臨床指標(biāo)的相關(guān)性(2)Bmi-1作為膀胱癌化療后進(jìn)展及死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素的單因素與多因素分析(3)生存分析結(jié)果1.膀胱癌順鉑與吉西他濱耐藥細(xì)胞系的建立及生物學(xué)特征分析(1)采用濃度交替遞增法成功建立了膀胱癌順鉑與吉西他濱耐藥細(xì)胞系T24/DDPGEM,其能在含有在終濃度為0.5ug/ml DDP或者2.5ug/ml GEM的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代。(2)經(jīng)過(guò)Western-Blot檢測(cè),T24/DDPGEM的P-gp表達(dá)量顯著提高。(3)CCK-8法測(cè)定計(jì)算出T24/DDPGEM細(xì)胞對(duì)于順鉑和吉西他濱的半數(shù)抑制濃度IC50分別為4.93±0.42μg/ml與45.97±3.35μg/ml。T24細(xì)胞對(duì)于順鉑和吉西他濱的半數(shù)抑制濃度IC50分別為1.16±0.24μg/ml與0.73±0.12μg/ml,T24/DDPGEM對(duì)于順鉑和吉西他濱的耐藥指數(shù)RI分別為4.25和62.97。(4)倒置相差顯微鏡下,親本T24細(xì)胞成圓形,橢圓形,邊界清楚,大小均勻,貼壁生長(zhǎng)。T24/DDPGEM細(xì)胞體積變大,異型性顯著,形態(tài)明顯不規(guī)則,細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)空泡和顆粒形成。(5)與親本T24細(xì)胞比較,T24/DDPGEM的生長(zhǎng)減緩。T24的倍增時(shí)間為(28.06±0.76)h,T24/DDPGEM 的倍增時(shí)間為(39.51±0.36)h 兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。倍增時(shí)間延長(zhǎng)(11.45±0.41)h。(6)經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)T24/DDPGEM和T24細(xì)胞周期分布分析,與T24細(xì)胞比較,T24/DDPGEM的G1期的細(xì)胞比例顯著增多,S期和G2期的細(xì)胞比例顯著減少。(7)相較于T24細(xì)胞,T24/DDPGEM對(duì)于順鉑和吉西他濱有著顯著提高的耐藥性。2.Bmi-1在耐藥膀胱癌中的表達(dá)及對(duì)膀胱癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響(1)通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)臨床上對(duì)于化療不敏感的膀胱癌患者的腫瘤組織切片中Bmi-1的表達(dá)明顯高于對(duì)于化療敏感的膀胱癌患者。膀胱癌耐藥細(xì)胞T24/DDPGEM的Bmi-1的表達(dá)量明顯高于T24細(xì)胞。(2)Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)構(gòu)建的3個(gè)Bmi-1的shRNA干擾質(zhì)粒能夠有效地干擾Bmi-1在T24和Biu-87細(xì)胞中的表達(dá)并選擇其中1個(gè)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),T24和Biu-87細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后成功過(guò)表達(dá)Bmi-1。(3)通過(guò)CCK-8法證實(shí)干擾Bmi-1能夠降低膀胱癌細(xì)胞對(duì)于順鉑的耐藥性,過(guò)表達(dá)Bmi-1能夠提高膀胱癌細(xì)胞對(duì)于順鉑的耐藥性。(4)成功構(gòu)建敲除Bmi-1的CRISPR/Cas9系統(tǒng),用慢病毒包裝并轉(zhuǎn)染了膀胱癌耐藥細(xì)胞株。通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 Bmi-1的表達(dá)量顯著下降。通過(guò)CCK8法和凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其耐藥性發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。3.Bmi-1影響膀胱癌細(xì)胞順鉑的耐藥性的機(jī)制(1)通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞中Bmi-1可以影響P-gp的表達(dá)。(2)通過(guò)Rodamin 123發(fā)現(xiàn)敲除Bmi-1之后膀胱癌耐藥細(xì)胞株藥物轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯下降。4.Bmi-1影響P-gp表達(dá)的可能的機(jī)制(1)miRNA 芯片。(2)差異miRNA分析。的表達(dá),從而上調(diào)P-gp。(4)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示Bmi-1可以負(fù)向調(diào)節(jié)hsa-miRNA-3682-3p的表達(dá)。(5)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示hsa-miRNA-3682-3p可以直接結(jié)合P-gp 的 mRNA 的 3'UTR。5.Bmi-1在膀胱癌化療后的臨床意義(1)相關(guān)性分析結(jié)果顯示Bmi-1與膀胱癌的分級(jí)、分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有著顯著的關(guān)系。(2)單因素與多因素分析顯示Bmi-1高表達(dá)是膀胱癌的化療后進(jìn)展和死亡的危險(xiǎn)因素。(3)生存分析結(jié)果顯示,Bmi-1高表達(dá)的膀胱癌病人在化療后有著較低的生存率。結(jié)論1.膀胱癌耐藥細(xì)胞株T24/DDPGEM構(gòu)建成功,具有穩(wěn)定的對(duì)于順鉑和吉西他濱的耐藥性,可以作為研究膀胱癌耐藥的很好的模型。2.Bmi-1在膀胱癌耐藥細(xì)胞株和臨床的化療不敏感的患者的腫瘤組織標(biāo)本中高表達(dá),提示Bmi-1可能與膀胱癌的耐藥有密切關(guān)系。在膀胱癌細(xì)胞中干擾Bmi-1可以降低其對(duì)于順鉑的耐藥性,過(guò)表達(dá)Bmi-1可以提高其對(duì)于順鉑的耐藥性,在膀胱癌耐藥細(xì)胞中敲除Bmi-1可以逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對(duì)于順鉑的耐藥性。3.在膀胱癌中Bmi-1是通過(guò)影響P-gp的表達(dá),從而影響膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的能力,繼而影響其對(duì)于順鉑的耐藥性的4.Bmi-1 可以抑制 hsa-miRNA-3682-3p 的表達(dá),而 hsa-miRNA-3682-3p 可以直接結(jié)合P-gp的mRNA的3'UTR。5.Bmi-1與膀胱癌化療的預(yù)后有著密切的關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.14
【圖文】：

逡逑圖１－１倒置顯微鏡下觀察�。玻�、Ｔ２４ＺＤＤＰ＆ＧＥＭ的形態(tài)（１００倍）逡逑Ａ邋：邋Ｔ２４邋Ｂ：邋Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆＴ２４，邋Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ邋ｕｎｄｅｒ邋ａｎ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋（ｌＯＯｘ）逡逑Ａ邋：Ｔ２４邋Ｂ：Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ逡逑細(xì)胞增殖能力的變化逡逑與Ｔ２４比較，Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ的生長(zhǎng)減緩。Ｔ２４的倍增時(shí)間為（２８．０６±０．７６）逡逑ｈ，Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ的倍增時(shí)間為（３９．５丨±０．３６）邋ｈ兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜逡逑０．００１）。Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ邋的倍增時(shí)間延長(zhǎng)（１１．４５±０．４丨）ｈ邋（圖邋１－２）。逡逑３１邋－＊■邋Ｔ２４邐＊＊＊逡逑令邋Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ邐，逡逑０＊邐＂＂邋１１邋＂邐Ｉ邐Ｉ逡逑０邐２邐４邐６逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｄ）逡逑圖丨－２邋ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)做生長(zhǎng)曲線顯示Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ相較于Ｔ２４細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋－２邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ＣＣＫ－８邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｓｈｏｗｓ邋ｔｈａｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｆ邋Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ邋ｓｌｏｗｓ逡逑ｄｏｗｎ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｔ２４邋ｃｅｌｌｓ．．邋＊ｐ＜０．０５，邋＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１逡逑２．邋ＣＣＫ－８法檢測(cè)Ｔ２４細(xì)胞和Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ細(xì)胞分別對(duì)ＤＤＰ和ＧＥＭ的半抑逡逑制濃度（ＩＣ５０）和耐藥指數(shù)（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ邋ｉｎｄｅｘ，Ｒｌ）逡逑對(duì)于邋ＤＤＰ

逡逑圖１－１倒置顯微鏡下觀察�。玻�、Ｔ２４ＺＤＤＰ＆ＧＥＭ的形態(tài)（１００倍）逡逑Ａ邋：邋Ｔ２４邋Ｂ：邋Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆＴ２４，邋Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ邋ｕｎｄｅｒ邋ａｎ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋（ｌＯＯｘ）逡逑Ａ邋：Ｔ２４邋Ｂ：Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ逡逑細(xì)胞增殖能力的變化逡逑與Ｔ２４比較，Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ的生長(zhǎng)減緩。Ｔ２４的倍增時(shí)間為（２８．０６±０．７６）逡逑ｈ，Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ的倍增時(shí)間為（３９．５丨±０．３６）邋ｈ兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜逡逑０．００１）。Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ邋的倍增時(shí)間延長(zhǎng)（１１．４５±０．４丨）ｈ邋（圖邋１－２）。逡逑３１邋－＊■邋Ｔ２４邐＊＊＊逡逑令邋Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ邐，逡逑０＊邐＂＂邋１１邋＂邐Ｉ邐Ｉ逡逑０邐２邐４邐６逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｄ）逡逑圖丨－２邋ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)做生長(zhǎng)曲線顯示Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ相較于Ｔ２４細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋－２邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ＣＣＫ－８邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｓｈｏｗｓ邋ｔｈａｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｆ邋Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ邋ｓｌｏｗｓ逡逑ｄｏｗｎ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｔ２４邋ｃｅｌｌｓ．．邋＊ｐ＜０．０５，邋＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１逡逑２．邋ＣＣＫ－８法檢測(cè)Ｔ２４細(xì)胞和Ｔ２４／ＤＤＰ＆ＧＥＭ細(xì)胞分別對(duì)ＤＤＰ和ＧＥＭ的半抑逡逑制濃度（ＩＣ５０）和耐藥指數(shù)（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ邋ｉｎｄｅｘ，Ｒｌ）逡逑對(duì)于邋ＤＤＰ

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1 薛東煒;TRIM24在膀胱癌組織中的表達(dá)及對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

2 鐘新泰;長(zhǎng)鏈非編碼RNA-SNHG7調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲性的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

3 黃麗娟;LASS2通過(guò)ERK/Drp1調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲和化療耐受性的初步研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

4 許明杰;miR-22在膀胱癌中的抑癌作用及其機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2018年

5 黃曉靜;異染色質(zhì)蛋白1γ促進(jìn)膀胱癌化療耐藥作用機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2018年

6 張青;miR34a/GOLPH3軸介導(dǎo)膀胱癌干性維持和化療耐藥的機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2018年

7 王輝;胱抑素C與膀胱尿路上皮腫瘤的臨床病理特征的相關(guān)性分析[D];山東大學(xué);2018年

8 魏鑫;miR-6838通過(guò)介導(dǎo)Rb通路促進(jìn)膀胱癌生長(zhǎng)和侵襲的能力及其機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2018年

9 曾蜀雄;ANLN基因在膀胱尿路上皮癌中的作用及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

10 張堅(jiān);環(huán)氧化酶2在膀胱癌發(fā)生發(fā)展以及治療中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 谷文;茶多酚抑制自噬對(duì)表柔比星介導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

2 陳柳;MT-12對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移影響的初步研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2018年

3 邢瀟瀟;UHRF1對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞和T24細(xì)胞增殖的影響[D];南京大學(xué);2013年

4 楊帆;RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3在鎘誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型中的作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

5 寧伯彬;長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19在膀胱癌細(xì)胞中作為ceRNA拮抗let-7d促進(jìn)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

6 李健;蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)BIU87與T24膀胱癌細(xì)胞增殖的影響[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

7 張?zhí)旄?DIVERSIN通過(guò)JNK通路促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞的增殖和侵襲[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

8 李世光;MCM3在膀胱癌中的表達(dá)及對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

9 何波;BAG2在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡中的作用的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

10 徐曉強(qiáng);膀胱癌細(xì)胞外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)研究[D];江南大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2739767