發(fā)布時(shí)間：2020-07-02 02:11

【摘要】：目的:肝細(xì)胞肝癌是發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤,2015年全球新發(fā)肝癌病例數(shù)超過85萬,死亡病例超過81萬,其中我國肝癌死亡病例也居高不下,死亡率在癌癥中排名第四位。肝癌起病隱匿,常較早發(fā)生轉(zhuǎn)移,就診時(shí)往往已是中晚期,加之治療手段有限,目前肝癌的診治仍是迫切需要解決的問題。因此積極探索肝癌的發(fā)病機(jī)制,尋找能預(yù)測(cè)臨床肝癌患者預(yù)后的分子標(biāo)記物,將為肝癌的診斷和治療提供新思路和理論依據(jù)。脂肪代謝在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮十分重要的作用,同時(shí)也是機(jī)體內(nèi)非常重要的代謝途徑。脂肪酸是能量代謝的重要底物,并且也是構(gòu)成生物膜脂質(zhì)和信號(hào)分子的重要組成成分~([1])。惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征之一是細(xì)胞異常增殖,而腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜形成和異常信號(hào)分子的傳遞過程需要更多的脂肪酸代謝參與~([2])。脂質(zhì)代謝改變作為腫瘤的一個(gè)重要代謝特點(diǎn),表現(xiàn)為脂肪酸從頭合成和氧化代謝活躍,這揭示癌變細(xì)胞可能會(huì)通過加強(qiáng)從頭合成來增加其所需的脂肪酸,從而為腫瘤細(xì)胞的高速增殖提供能量~([3])。SLC27(solute carrier family 27)編碼的蛋白稱為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(fatty acid transport proteins,FATPs),它們屬于介導(dǎo)長鏈和極長鏈脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的載體蛋白家族,在動(dòng)物組織細(xì)胞脂肪酸和脂肪代謝中發(fā)揮重要作用。SLC27A5(solute carrier family 27 member 5)作為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員,在肝臟特異高表達(dá),提示其對(duì)于肝臟的脂肪酸代謝具有重要的調(diào)控作用。有文獻(xiàn)報(bào)道,SLC27A5基因敲除小鼠肝細(xì)胞脂肪酸吸收率降低了50%,游離脂肪酸和甘油三酯含量相應(yīng)降低,且未發(fā)現(xiàn)FATPs其他家族成員有代償性表達(dá)升高,說明肝細(xì)胞SLC27A5對(duì)長鏈脂肪酸的攝取、維持肝臟脂質(zhì)平衡均發(fā)揮了非常重要的作用~([4])。但是SLC27A5對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響及相關(guān)的機(jī)制尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,課題組前期實(shí)驗(yàn)中,通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選到肝癌組織差異低表達(dá)基因SLC27A5,TCGA數(shù)據(jù)庫分析也證實(shí)了其在肝癌組織中低表達(dá)。因此本實(shí)驗(yàn)主要研究SLC27A5對(duì)肝癌細(xì)胞增殖遷移能力的影響及其相關(guān)機(jī)制探討。實(shí)驗(yàn)方法:1、通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選到肝癌組織差異低表達(dá)基因SLC27A5,運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步分析TCGA數(shù)據(jù)庫SLC27A5在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)情況,分析SLC27A5表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系。2、采用Western blot、qRT-PCR和免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemistry,IHC)方法檢測(cè)SLC27A5在40對(duì)臨床肝癌和癌旁組織的表達(dá)。采用Western blot檢測(cè)SLC27A5在正常肝臟細(xì)胞和不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)。3、運(yùn)用基因重組技術(shù)構(gòu)建SLC27A5過表達(dá)質(zhì)粒,利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建Ad SLC27A5重組腺病毒表達(dá)載體。肝癌細(xì)胞感染AdSLC27A5重組腺病毒,采用MTS實(shí)驗(yàn)、Edu(5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷)實(shí)驗(yàn)和直接克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)SLC27A5對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響;采用transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SLC27A5對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。4、運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)方法及查閱文獻(xiàn),選取與腫瘤增殖遷移相關(guān)的靶基因SLC39A6(solute carrier family 39 member 6),IGFBP1(insulin-like growth factor binding protein 1)和TXNRD1(Thioredoxin reductase 1),采用qRT-PCR和Western blot,分別在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證靶基因的表達(dá)改變。5、采用Western blot、qRT-PCR和IHC方法檢測(cè)SLC27A5和其下游靶基因TXNRD1在肝癌和癌旁組織的表達(dá)相關(guān)性。采用免疫熒光(Immunofluorescence,IF)和Western blot方法檢測(cè)Nrf2的核轉(zhuǎn)位。6、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SLC27A5對(duì)體內(nèi)腫瘤形成能力的影響。運(yùn)用Western blot、qRT-PCR和IHC方法在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證SLC27A5和其下游靶基因TXNRD1的相關(guān)性。結(jié)果:1、采用Western blot、q RT-PCR方法檢測(cè)了40對(duì)肝癌和癌旁組織標(biāo)本SLC27A5的表達(dá)情況,Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)有27對(duì)標(biāo)本SLC27A5表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì),占67.5%,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC27A5表達(dá)也明顯降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。采用IHC方法檢測(cè)了18對(duì)肝癌和癌旁組織標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)SLC27A5在肝癌組織中表達(dá)下調(diào),其在細(xì)胞內(nèi)定位主要位于胞漿。說明SLC27A5在肝癌組織的表達(dá)明顯低于癌旁組織。2、構(gòu)建SLC27A5重組腺病毒質(zhì)粒并包裝成重組腺病毒,通過Western blot鑒定其過表達(dá)效果;通過MTS、EdU及直接克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)SLC27A5過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖功能的影響。MTS結(jié)果顯示:與Mock組和AdGFP組相比,AdSLC27A5組在細(xì)胞接種后96h開始生長速度減慢,且在120h時(shí)表現(xiàn)最明顯;EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與Mock組和AdGFP組相比,AdSLC27A5組細(xì)胞內(nèi)新合成的DNA明顯減少;直接克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:AdSLC27A5組細(xì)胞克隆形成數(shù)相較于Mock組、AdGFP組明顯減少;通過wound healing實(shí)驗(yàn)與transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SLC27A5過表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力的影響,wound healing實(shí)驗(yàn)顯示:AdSLC27A5組與Mock組、Ad GFP組比較,細(xì)胞遷移率明顯降低;transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示:AdSLC27A5組的細(xì)胞遷移侵襲數(shù)目明顯低于Mock組、AdGFP組。說明SLC27A5在體外具有抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移的能力。3、通過RNA-Seq篩選到SLC27A5相關(guān)的靶基因TXNRD1,運(yùn)用Real-time PCR和Western bolt的方法驗(yàn)證其mRNA和蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)當(dāng)SLC27A5過表達(dá)時(shí),TXNRD1水平降低,并且兩者的表達(dá)具有相關(guān)性;運(yùn)用Western bolt和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)調(diào)控TXNRD1表達(dá)的上游重要信號(hào)分子Nrf2的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)當(dāng)SLC27A5過表達(dá)時(shí),Nrf2在胞核中的蛋白水平下降及其熒光表達(dá)減弱。說明SLC27A5通過調(diào)控keap1/Nrf2信號(hào)通路,從而下調(diào)TXNRD1的表達(dá)。4、分別將MHCC-97H細(xì)胞、感染Ad GFP的MHCC-97H細(xì)胞和感染Ad SLC27A5重組腺病毒的MHCC-97H細(xì)胞注入裸鼠皮下,觀察腫瘤生長情況,6周后處死裸鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),AdSLC27A5組的裸鼠皮下腫瘤重量、體積明顯小于對(duì)照組;通過熒光定量PCR、蛋白印跡法及免疫組化染色技術(shù),在體內(nèi)腫瘤組織中驗(yàn)證SLC27A5與TXNRD1之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。說明在裸鼠荷瘤模型SLC27A5能夠抑制腫瘤的形成。結(jié)論:SLC27A5通過Keap1/Nrf2信號(hào)通路靶向下調(diào)TXNRD1從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。在本課題中,我們首次檢測(cè)了SLC27A5在肝癌組織中的表達(dá)情況,并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中探討其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖遷移作用的影響,本課題嘗試揭示SLC27A5抑制肝癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制,并有望為肝癌的臨床診治提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7
【圖文】：

A B 1 A、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝回顧；B 細(xì)胞內(nèi)限制脂肪酸途徑可能抑制癌細(xì)胞增殖的模型[24]脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATPs）的主要生物學(xué)功能溶質(zhì)載體家族 27（Solute Carrier Family 27A，SLC27A），又稱脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)白家族（FattyAcid Transporters，F(xiàn)ATPs），由 Schaffer 等首先在小鼠的 3T3-L1肪細(xì)胞 cDNA 文庫中通過克隆表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)。目前，在人和鼠的基因組中已確了 6 個(gè)成員家族（FATP1-6)[24-25]。SLC27A5 編碼的蛋白為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 5FATP5），因 FATP5 蛋白具有�；o酶 A 的功能，所以又被稱為極長鏈�；o A 合成酶同工酶（Very Long-Chain Acyl-CoA Synthetase Homolog）[26]。SLC27A5因位于 19 號(hào)染色體，編碼的蛋白分子量為 75kD，在肝臟中特異表達(dá)。SLC27A5要的生物活性包括：一、作為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，能增加長鏈脂肪酸極長鏈脂肪酸的攝取；二、具有�；o酶 A 合成酶活性，參與肝臟中的脂質(zhì)合

2.1 Western bolt 檢測(cè) SLC27A5 在人正常肝臟細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的蛋白表達(dá) protein expression of SLC27A5in human normal liver cells and hepatocarcinoC27A5 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定膠電泳結(jié)果顯示，目的基因 SLC27A5 經(jīng) PCR 擴(kuò)增的片段大小約d-Track-SLC27A5 載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶 KpnI 和 HindⅢ雙酶切后與擴(kuò)增片段大小一致，pAdEasy-SLC27A5 重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng) Pa小與擴(kuò)增片段大小也一致，將 DNA 序列送檢測(cè)序，經(jīng) DNA ssis正確，表明 SLC27A5 重組腺病毒載體構(gòu)建成功（圖 2.2）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 方玲娟;王建設(shè);;先天性膽汁酸合成障礙與膽汁淤積性肝病[J];臨床肝膽病雜志;2010年06期

2 Maria J Monte;Jose JG Marin;Alvaro Antelo;Jose Vazquez-Tato;;Bile acids:Chemistry,physiology,and pathophysiology[J];World Journal of Gastroenterology;2009年07期

3 馮愛娟;陳東風(fēng);樊麗琳;胡輅;史洪濤;;FATP4在大鼠非酒精性脂肪肝中的表達(dá)及相關(guān)性[J];重慶醫(yī)學(xué);2007年08期

本文編號(hào)：2737602