【摘要】：分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma,DTC)占全部甲狀腺癌的90%以上,又可以分類為濾泡狀甲狀腺癌和乳頭狀甲狀腺癌。近年來,分化型甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。DTC患者的腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)15%～30%。甲狀腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)是由甲狀腺濾泡細(xì)胞合成分泌的660 kDa的大分子糖蛋白,是合成甲狀腺激素的基質(zhì)。分化良好的DTC細(xì)胞可合成和分泌Tg。當(dāng)DTC患者接受甲狀腺切除術(shù)及131碘治療以后,血清Tg唯一的合理來源為DTC細(xì)胞活動(dòng)釋放。血清Tg可作為DTC特異性腫瘤標(biāo)志物,應(yīng)用于DTC患者術(shù)后的長(zhǎng)期隨訪監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷。為了建立檢測(cè)人血清甲狀腺球蛋白的雙抗體夾心 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法,我們首先選擇天然人源Tg蛋白免疫BALB/c小鼠,進(jìn)行三次免疫后取小鼠血清,利用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。選擇效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行沖擊免疫,4 d后進(jìn)行細(xì)胞融合。通過間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞并亞克隆,最終獲得了7株能穩(wěn)定、高效分泌抗Tg蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株,分別命名為1B5、5E1、5F11、5F12、6E5、9E3、12H8。利用雜交瘤細(xì)胞通過體內(nèi)誘生腹水法制備小鼠的腹水,并對(duì)腹水效價(jià)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示1B5抗體效價(jià)大于1:6 400,其余6株抗體效價(jià)可達(dá)1:25 600。然后利用硫酸銨沉淀和蛋白質(zhì)G親和層析法對(duì)腹水中的抗體進(jìn)行了純化。利用間接ELISA法對(duì)單克隆抗體的亞型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,除9E3為IgG2a外,其他6株抗體均為IgG1。利用所制備的單克隆抗體建立了檢測(cè)Tg的雙抗體夾心ELISA方法,并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了條件優(yōu)化。建立的雙抗體夾心ELISA方法敏感性可達(dá)1ng/mL。用構(gòu)建的體系與臨床用商品化的試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果表明臨床樣本檢測(cè)值與醫(yī)院臨床值相關(guān)性較好。本課題的開展,為今后開發(fā)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的甲狀腺球蛋白診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.51
【圖文】：

通過間接ＥＬＩＳＡ法檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)，陰性對(duì)照為未免疫小鼠血逡逑清。設(shè)定大于陰性值的２．１倍為陽(yáng)性值。小鼠在初次免疫后體內(nèi)抗體效價(jià)較低，逡逑在第二次和第三次免疫后可以發(fā)現(xiàn)血清陽(yáng)性值０Ｄ值明顯上升（圖３－１），說明逡逑Ｔｇ能在小鼠體內(nèi)引起一定的免疫反應(yīng)，作為抗原具有良好的免疫原性。在第三逡逑次免疫后第１４邋ｄ，檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)，結(jié)果如表３－１所示，４只小鼠效價(jià)逡逑均達(dá)１邋：邋４００邋０００以上，達(dá)到細(xì)胞融合要求，可對(duì)小鼠進(jìn)行沖擊免疫后進(jìn)行細(xì)胞融逡逑合。逡逑１邋５－｜逡逑■Ｉ實(shí)驗(yàn)組小鼠逡逑Ｉ邐W柋對(duì)照逡逑Ｃ邋｜逡逑免疫次數(shù)逡逑圖３－１小鼠血清四十萬倍稀釋后抗體效價(jià)逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｔｉｔｅｒｓ邋ｏｆ邋ｓｅｒｕｍ邋ｉｎ邋ｍｉｃｅ邋ａｆｔｅｒ邋ｄｉｌｕｔｅｄ邋ｆｏｕｒ邋ｈｕｎｄｒｅｄ邋ｔｈｏｕｓａｎｄ逡逑２２逡逑

３．４純化后的單克隆抗體蛋白濃度逡逑用ＢＣＡ試劑盒測(cè)定純化的單克隆抗體濃度，通過標(biāo)準(zhǔn)品ＢＳＡ繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，逡逑獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為ｙ邋＝邋０．９４２５邋ｘ－０．０６７６，邋Ｒ２邋＝邋０．９９５２邋（表３－３、圖３－３），根據(jù)抗逡逑２４逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2733732