【摘要】：結(jié)直腸癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤之一,嚴(yán)重危害人類生命健康。近年來,隨著我國居民生活水平的提高,生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,其發(fā)病率及死亡率均居常見惡性腫瘤前列。目前認(rèn)為,改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后的主要手段是提高其早期診治率。但結(jié)直腸癌的早期診治手段有限,對于晚期患者,治療方案不多且效果欠佳,造成這一窘境的重要原因就是目前結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前,基因調(diào)控學(xué)說、腫瘤干細(xì)胞學(xué)說和炎癥學(xué)說是其發(fā)病機(jī)制的主要研究方向�；蛘{(diào)控學(xué)說已在多項研究中被證實,在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要作用�；虻谋磉_(dá)受多種因素的影響,近年來,隨著生物信息學(xué)、基因測序等技術(shù)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)circRNA(circular RNA,circRNA)是一類新穎的可在哺乳動物體內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)、具有高度保守序列并能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)發(fā)揮重要調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼RNA。已有多項研究證實,circRNA的異常表達(dá)及調(diào)控與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),這其中包括肝癌、胃癌及結(jié)直腸癌等。CircRNA在人體內(nèi)含量豐富、種類繁多,目前已被研究的circRNA只是極少數(shù),仍有大量具有重要生物學(xué)功能的circRNA有待人們挖掘。因此,尋找在結(jié)直腸癌中存在差異表達(dá)并具有重要生物學(xué)功能的circRNA將為闡明結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ),為結(jié)直腸癌的診治提供新的靶點及思路。目的:篩選并鑒定1個參與結(jié)直腸癌進(jìn)程調(diào)控的circRNA方法:1)從高通量測序數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫(Sequence read archive,SRA)中下載已經(jīng)公布的,12對結(jié)直腸癌及癌旁組織的RNA測序結(jié)果。首先,利用 FASTQ、TopHat2、Find_circ 軟件,結(jié)合 UCSC(University of California Santa Cruz)數(shù)據(jù)庫,按設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)(FDR0.05,Fold change≥2),篩選出在結(jié)直腸癌及癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA。然后通過Targetscan、miRanda、starbase預(yù)測差異表達(dá)circRNA的調(diào)控靶點,選出能夠同時在三款預(yù)測軟件中均取得良好預(yù)測結(jié)果的circRNA,構(gòu)建他們的共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最后應(yīng)用DAVID、Pathway Studio軟件結(jié)合KEEG(Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes)數(shù)據(jù)庫對他們下游靶基因的潛在生物學(xué)功能進(jìn)行分析。2)利用qRT-PCR檢測上述circRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平,選出有顯著差異表達(dá)的circRNA。隨后分析他們的circRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)節(jié)點,選定一個circRNA作為進(jìn)一步研究對象。最后利用瓊脂糖凝膠電泳及連接點測序驗證該circRNA的成環(huán)性,通過RNaseR實驗,驗證其穩(wěn)定性。3)收集40例結(jié)直腸癌患者手術(shù)標(biāo)本(癌和癌旁)及相關(guān)臨床病理資料,檢測circHIPK3在癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)合患者臨床資料,找出與circHIPK3表達(dá)水平相關(guān)的臨床病理特征。4)培養(yǎng)HT29、SW480、LoVo、CAC02結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞株及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株(FHC)。檢測不同細(xì)胞株中circHIPK3的表達(dá)情況,選擇合適細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步功能實驗。構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染,利用qRT-PCR檢測circHIPK3轉(zhuǎn)染效率。通過CCK-8、平板克隆、凋亡、劃痕及Transwell實驗驗證circHIPK3功能。最后結(jié)合第一部分的生物信息學(xué)分析及既往研究,推測circHIPK3的可能調(diào)控機(jī)制。利用qPCR檢測circHIPK3與可能調(diào)控靶miRNA在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:1)經(jīng)FASTQ、TopHat2、Find_circ軟件篩選,在RNA測序結(jié)果中共找到12個在結(jié)直腸癌及癌旁組織中存在差異表達(dá)circRNA,其中上調(diào)的為6個,下調(diào)的6個。能夠同時在三個靶點預(yù)測軟件中均取得良好預(yù)測結(jié)果的 circRNA 共 4 個(hsa_circ_0000284,hsa_circ_0000400,hsa_circ_0000523,hsa_circ_0087960)。GO 及 pathway 分析結(jié)果提示,該組circRNA所調(diào)控的蛋白主要參與到細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞對藥物的抵抗及組織重塑等生物學(xué)過程中,信號通路主要富集于Foxo及P53通路。2)上述 4 個 circRNA 的 qRT-PCR 檢測結(jié)果提示,hsa_circ_0000400(circTUBA1B)及 hsa_circ_0000284(circHIPK3)在癌及癌旁組織中存在顯著差異表達(dá)(p0.05)。分析circTUBA1B和circHIPK3的circRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),我們發(fā)現(xiàn)circHIPK3較circTUBA1B有更多的節(jié)點,其具有重要生物學(xué)功能的可能性更大,因此選擇circHIPK3為進(jìn)一步研究對象。瓊脂糖凝膠電泳及連接點測序結(jié)果提示,circHIPK3能形成良好的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。RNase R結(jié)果提示,在RNA分子中加入RNaseR后,circHIPK3仍有較高表達(dá),而mHIPK3表達(dá)較對照組顯著下降(p0.05),證實了 circHIPK3的穩(wěn)定性。3)40對結(jié)直腸癌及癌旁組織qPCR結(jié)果提示,circHIPK3的在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)較癌旁顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)合患者臨床病理資料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),circHIPK3的表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、分化程度無明顯相關(guān)性,而與腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p0.05)。4)細(xì)胞實驗結(jié)果顯示,circHIPK3在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平較FHC細(xì)胞株降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),我們選擇了LoVo及SW480細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步功能實驗。質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組circHIPK3表達(dá)水平較對照組顯著升高。CCK-8、平板克隆、凋亡、劃痕及Transwell實驗結(jié)果證實,circHIPK3過表達(dá)組細(xì)胞株較對照組細(xì)胞增殖及遷移能力下降,凋亡比例增加。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),circHIPK3可能是通過circHIPK3-miR-20a-5p-P53軸來參與結(jié)直腸癌進(jìn)程調(diào)控的。qPCR結(jié)果提示circHIPK3與miR-20a-5p的△CT在結(jié)直腸癌組織中呈負(fù)相關(guān)(r =-0.7378,p = 0.0149)。結(jié)論:(1)CircHIPK3在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)下調(diào),低的circHIPK3表達(dá)與患者腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān);(2)CircHIPK3抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和遷移;(3)CircHIPK3可能是一個負(fù)性結(jié)直腸癌進(jìn)程調(diào)控因子。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34
【圖文】：

圖１．１差異表達(dá)ｃｉｒｃＲＮＡ的火山圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１，１邋Ｖｏｌｃａｎｏ邋ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｃｉｒｃＲＮＡ逡逑ＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建逡逑用Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、Ｓｔａｒｂａｓｅ三款預(yù)測軟件對上述差下游ｍｉＲＮＡ及最終調(diào)控的ｍＲＮＡ進(jìn)行預(yù)測。同時在三個預(yù)測預(yù)測靶點的有邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００５２３邋（邋ｃｉｒｃＭＥＴＴＬ３邋），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ３），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００８７９６０邋（ｃｉｒｃＬＰＡＲｌ）及邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００４００邋（ｃｉｒｃＴ果，構(gòu)建該組ｃｉｒｃＲＮＡ的ｃｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共調(diào)控網(wǎng)示，這些ｃｉｒｃＲＮＡ存在多個可能的ｍｉＲＮＡ結(jié)合位點，并可最終參與到基因表達(dá)的調(diào)控中。逡逑

邐４逡逑Ｆｏｌｄ邋ｃｈａｎｇｅ逡逑圖１．１差異表達(dá)ｃｉｒｃＲＮＡ的火山圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１，１邋Ｖｏｌｃａｎｏ邋ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｃｉｒｃＲＮＡ逡逑３．３邋ＣｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建逡逑同時應(yīng)用Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、Ｓｔａｒｂａｓｅ三款預(yù)測軟件對上述差異表達(dá)的逡逑ｃｉｒｃＲＮＡ的下游ｍｉＲＮＡ及最終調(diào)控的ｍＲＮＡ進(jìn)行預(yù)測。同時在三個預(yù)測軟件中均逡逑獲得較好預(yù)測靶點的有邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００５２３邋（邋ｃｉｒｃＭＥＴＴＬ３邋），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００２８４逡逑（ｃｉｒｃＨＩＰＫ３），ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００８７９６０邋（ｃｉｒｃＬＰＡＲｌ）及邋ｈｓａ＿ｃｉｒｃ＿００００４００邋（ｃｉｒｃＴＵＢＡｌＢ），逡逑根據(jù)預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建該組ｃｉｒｃＲＮＡ的ｃｉｒｃＲＮＡ－ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如下逡逑圖。該圖顯示，這些ｃｉｒｃＲＮＡ存在多個可能的ｍｉＲＮＡ結(jié)合位點，并可能通過對他逡逑們的調(diào)節(jié)，最終參與到基因表達(dá)的調(diào)控中。逡逑２６逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 邵婧嫻;朱利芹;馬晶晶;杜楠;何敬東;;結(jié)直腸癌特征性環(huán)狀RNA篩選[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年11期

本文編號：2731319