【摘要】：研究背景:目前,肺癌的臨床治療效果,在肺癌機(jī)制研究以及臨床藥物開發(fā)不斷發(fā)展的推動(dòng)下取得了很大進(jìn)步,但是肺癌病人的死亡率仍然位居首位,其5年生存率仍低于15%,這些主要是肺癌復(fù)發(fā)、耐藥、以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移所致。耐藥常常是因?yàn)樗幬镎T導(dǎo)凋亡失敗導(dǎo)致,肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移在患者初診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生,但因早、晚期肺癌的癥狀在臨床上沒有明顯的差別,因此肺癌的轉(zhuǎn)移過程不易被發(fā)現(xiàn),這無疑地給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。因晚期肺癌患者錯(cuò)過了手術(shù)治療的最佳時(shí)期,其治療方案就只能以化療、放療為主。而常規(guī)化療藥物副作用大,而且容易發(fā)生耐藥,因此研發(fā)出腫瘤細(xì)胞對(duì)其敏感,且同時(shí)具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移功效的藥物具有重要價(jià)值。腫瘤細(xì)胞耐藥因凋亡失敗導(dǎo)致,為了提高藥物的敏感性,改善腫瘤的治療效果,尋找一種可代替細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡形式,并采用對(duì)人體毒性低的強(qiáng)效抗腫瘤藥將給癌癥的治療帶來新的前景。自噬,不同于凋亡的另外一種程序性細(xì)胞死亡形式。近年來的研究表明,姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷效應(yīng),其中包括凋亡和自噬,且具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能,姜黃素對(duì)凋亡的作用機(jī)制已經(jīng)有大量報(bào)道,但其與肺癌細(xì)胞自噬間的相關(guān)性及作用機(jī)制并不完全清楚。為了有效地改善臨床上肺癌的治療效果、抑制肺癌轉(zhuǎn)移,深入了解姜黃素抗肺癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制成為腫瘤研究領(lǐng)域的重要課題。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),是指具有極性結(jié)構(gòu)的上皮細(xì)胞喪失了緊密連接的結(jié)構(gòu)的過程,在該過程中,上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特征、獲得了間質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記物,且具有了更強(qiáng)的侵襲和遷移能力。EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移具有相同的特點(diǎn),就是其調(diào)節(jié)因素多,機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。在眾多調(diào)節(jié)成分中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一個(gè)很重要的促EMT因子。因?yàn)镋MT過程很短暫,因此很難直接在肺癌患者體內(nèi)觀察到EMT過程,通過已經(jīng)確定的EMT的刺激因素作用于細(xì)胞或者動(dòng)物來建立EMT模型,進(jìn)行EMT機(jī)制的深入研究,也就成為國(guó)內(nèi)外比較常用的研究方法。EMT過程的調(diào)節(jié)機(jī)制中,很多信號(hào)通路包括PI3K/AKT、Ras-MAPK、Hedgehog、rho、src以及wnt通路等通過協(xié)同、拮抗相互交叉對(duì)emt進(jìn)行調(diào)節(jié)。其中wnt通路對(duì)emt的調(diào)節(jié)越來越受重視。wntinhibitoryfactor-1(wif-1)是wnt通路的關(guān)鍵拮抗因子之一、也是一重要的抑癌基因。有報(bào)道認(rèn)為wif-1因啟動(dòng)子過度甲基化而導(dǎo)致表達(dá)下降,我們的前期研究也已證實(shí)wif-1在有些非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)呈下調(diào)或者不表達(dá)狀態(tài),但這與細(xì)胞類型有關(guān),也即是并非在所有的肺癌細(xì)胞中wif-1都呈低表達(dá)狀態(tài)。95d細(xì)胞、95c細(xì)胞中wif-1的表達(dá)情況需要用實(shí)驗(yàn)來明確。有報(bào)道認(rèn)為wif-1表達(dá)的上調(diào)能夠抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。我們前期研究發(fā)現(xiàn),雙脫甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin,bdmc),也稱為姜黃素-3,能使特定的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中wif-1表達(dá)上調(diào)。木課題以人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞95d為主要研究對(duì)象,研究姜黃素-3對(duì)該細(xì)胞的的作用及其對(duì)emt的效應(yīng)及機(jī)制。課題設(shè)想:根究國(guó)內(nèi)外的研究及我們前期的發(fā)現(xiàn),提出以下研究設(shè)想:姜黃素-3能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬。而且該自噬作用是有利于腫瘤細(xì)胞向死亡的方向發(fā)展。此外,因sonichedgehog通路與自噬有關(guān),且姜黃素-3能夠調(diào)控hedgehog通路,因此推測(cè)姜黃素-3通過調(diào)節(jié)sonichedgehog通路誘導(dǎo)自噬。另外,wif-1基因與肺癌的侵襲和遷移能力有關(guān),姜黃素-3能夠通過恢復(fù)wif-1的表達(dá),抑制wnt通路。以此推斷,姜黃素-3可能通過wif-1發(fā)揮對(duì)95d細(xì)胞emt過程的抑制,從而阻礙了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲的生物學(xué)活性。本文的目的是闡明姜黃素-3在抗腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制,為肺癌轉(zhuǎn)移的治療和預(yù)防提供理論依據(jù),同時(shí)為肺癌的靶向治療方案提供新思路。研究方法(1)利用cck8試驗(yàn)觀察姜黃素-3對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(包括a549細(xì)胞、高轉(zhuǎn)移非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞95d細(xì)胞)活性的作用情況;(2)利用熒光斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、免疫印跡(westernbloting,wb)、電鏡、流式細(xì)胞儀、基因干擾等方法檢測(cè)姜黃素-3對(duì)a549、95d細(xì)胞自噬的作用并探索其作用機(jī)制,同時(shí)探討自噬對(duì)凋亡和細(xì)胞活性的作用的影響;(3)利用tgf-β1作為誘發(fā)因素刺激95d細(xì)胞,建立emt模型;(4)利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)姜黃素-3對(duì)tgf-β1作用下95d細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響;(5)利用免疫熒光、wb、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(rt-pcr)檢測(cè)姜黃素-3對(duì)tgf-β1誘導(dǎo)的95d細(xì)胞emt過程作用;(6)利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達(dá)wif-1的95d細(xì)胞系,觀察95d細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變,以及emt分子標(biāo)記物表達(dá)的變化;(7)利用基因干擾抑制基因表達(dá)方法來檢測(cè)姜黃素-3對(duì)95d細(xì)胞自噬、emt的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)姜黃素-3可抑制95d細(xì)胞的生長(zhǎng)活性,且其作用具有濃度和時(shí)間依賴性。但濃度值在10μmol/l以下的姜黃素-3對(duì)95d細(xì)胞的活性沒有影響。(2)姜黃素-3能夠誘導(dǎo)95d細(xì)胞自噬,該自噬作用能夠降低細(xì)胞活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。(3)hedgehog通路的抑制能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生;(4)姜黃素-3能夠抑制hedgehog信號(hào)通路,結(jié)合上一條結(jié)果可推斷姜黃素-3誘發(fā)自噬的機(jī)制部分是通過抑制hedgehog通路實(shí)現(xiàn)的;(5)tgf-β1能夠誘導(dǎo)95d細(xì)胞發(fā)生emt、tgf-β1能夠促使wif-1的表達(dá)下降,且能激活wnt通路;(6)姜黃素-3能夠抑制tgf-β1誘導(dǎo)的95d細(xì)胞的侵襲和遷移以及emt過程、說明姜黃素-3具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性;(7)wif-1的過表達(dá)抑制了95d細(xì)胞的侵襲和遷移,及emt過程也受到了抑制。wif-1的表達(dá)能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移;(8)姜黃素-3能夠恢復(fù)wif-1的表達(dá),抑制wnt通路,說明姜黃素-3的抗瘤作用是通過上調(diào)wif-1癌基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn);(9)利用rna干擾的辦法阻斷wif-1,發(fā)現(xiàn)對(duì)wif-1的抑制能夠阻斷姜黃素-3對(duì)95d細(xì)胞的emt過程的抑制作用,說明wif-1是姜黃素-3抗腫瘤轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn);結(jié)論(1)姜黃素-3對(duì)正常的細(xì)胞沒有毒性,而對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)活性具有明顯的抑制作用,且可誘導(dǎo)凋亡和自噬兩種形式的細(xì)胞死亡。(2)姜黃素-3誘導(dǎo)自噬的機(jī)制是通過抑制hedgehog信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。(3)姜黃素-3可以通過上調(diào)wif-1的表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞的emt,進(jìn)而抑制其侵襲和遷移。說明姜黃素-3是一個(gè)多靶點(diǎn)的藥物,在對(duì)抗腫瘤耐藥和腫瘤轉(zhuǎn)移治療方面具有可觀的前景。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2731202