【摘要】：RAS相關蛋白家族成員Rap2b是一種新發(fā)現的p53下游靶基因。當p53+/+細胞受到外源性刺激時(如阿霉素給藥),p53被激活,導致細胞內Rap2b蛋白的表達量顯著增加,從而促進腫瘤細胞的生存。我們推測,Rap2b是一個有效的腫瘤治療靶點。為此,本文設計了一種以納米材料為載體的藥物/基因遞送系統(tǒng),用于評估Rap2b siRNA作為一種抗腫瘤治療藥物的潛力。同時本文通過研究Rap2b與p53之間的相互作用,為闡明Rap2bsiRNA的抗腫瘤機制提供重要線索。首先,為了便于后續(xù)實驗,我們制備了 Rap2b單克隆抗體。共得到八個單克隆抗體穩(wěn)定細胞株。酶聯免疫吸附實驗結果顯示八株均為IgG1類抗體。同時免疫印跡法結果顯示抗體的最低使用濃度為0.1 μg/mL,所能檢測到的蛋白最低量為5 ng。然后,我們通過氯金酸法合成了金納米殼顆粒,并將合成的Rap2bsiRNA和阿霉素連接到金納米殼上。納米粒子與HCT116細胞共孵育后,在熒光顯微鏡下可見裝載有阿霉素和Rap2b siRNA的金納米殼被腫瘤細胞吸收。激光照射能顯著促進金納米殼釋放阿霉素和Rap2b siRNA,而且釋放的Rap2b siRNA能顯著降低細胞內Rap2b的表達水平。接著,我們通過體外和體內實驗評價了不同藥物聯用對腫瘤細胞的殺傷效應。結果顯示,降低Rap2b的表達水平能顯著增強阿霉素對于腫瘤細胞的殺傷效果。同時,激光照射納米粒子產生的熱能能對腫瘤細胞產生額外的殺傷作用,進一步提高了阿霉素的腫瘤治療效果。最后,我們通過體外GST pulldown實驗和體內雙分子熒光互補實驗證明了 Rap2b與p53之間存在直接相互作用。為了確定這兩種蛋白互作的結構域,我們構建了一系列Rap2b和p53的截短突變體,再通過體外GSTpullldown實驗和雙分子熒光互補實驗確定了 Rap2b的第41-135位氨基酸殘基和p53的DNA結合結構域是二者直接相互作用的區(qū)域。綜上所述,本研究證明了 Rap2b siRNA能顯著增強阿霉素的抗腫瘤療效,而且Rap2b能與p53直接結合,推測Rap2b可能通過與p53直接結合而負反饋調控p53的活性。這些發(fā)現有助于深入理解Rap2b和p53在腫瘤發(fā)生發(fā)展和耐藥性形成中的作用,為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新靶點,對于惡性腫瘤的防治具有重要意義。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.5
【圖文】：

后根據細胞類型和脅迫類型的不同，活化的ｐ５３可通過激活下游不同的靶基因進而誘導不逡逑同的生物學效應，例如細胞周期阻滯、ＤＮＡ修復、細胞凋亡以及抗血管生成和細胞衰老（見逡逑圖１－１）等，從而表現出腫瘤抑制作用。近年來也有研究表明ｐ５３在干細胞分化過程中具逡逑有重要作用（Ｌｅｅ邋Ｋ．邋Ｈ．，ｅｆ邋ａ人，２０１０；邋Ｊｏｅｒｇｅｒ邋Ａ．邋Ｃ．邋ａｎｄ邋Ａ．邋Ｒ．邋Ｆｅｒｓｈｔ．，邋２００８；邋Ｚｈａｎｇ，邋Ｘ．，ｅｆ邋ａ／，逡逑２０１３）。因此，篩選并鑒定ｐ５３的祀基因，同時研宄這些靶基因的功能及其分子機制對于全逡逑面而深入的了解ｐ５３的功能，尤其是ｐ５３在腫瘠發(fā)生、發(fā)展中的作用以及尋找新的腫瘤治逡逑療靶點等方面都具有非常重要的意義。逡逑

逑在之前的研究中，研究者們利用基因芯片技術結合ＣＨ［Ｐ－ｃｈｉｐ技術在基因組水平篩選逡逑ｐ５３靶基因時，發(fā)現了一個具有促腫瘤細胞生存功能的新靶基因ＲａＰ２ｂ邋（見圖１－２）邋（Ｚｈａｎｇ，逡逑Ｘ．，邋ｅｔ邋ａ／．，２０１３）0逡逑Ａ邋Ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅ邐ｐ５３邋ｃｈｒｏｍａｔｉｎ邋ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｃｈａｎｇｅ，邋ｐ＜０．００１逡逑ＭＥＦ邐ｍＥＳ邐ＭＥＦ邐ｍＥＳ逡逑＾＾３邐２９７０＾＾邋２４２逡逑ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑Ｉ邋—邋Ａｌｏｘ５逡逑—Ｅｄａ２ｒ逡逑－Ｂｔｇ２逡逑－Ｍｄｍ２逡逑—Ａｄｒｂ２逡逑—Ｃｄｋｎｌａ逡逑－ＴｎｆｒｓｆｌＯｂ逡逑—Ｒａｐ２ｂ逡逑－Ｂｂｃ３逡逑圖１－２．邋ｐ５３新靶基因Ｒａｐ２ｂ的篩選示意圖（Ｚｈａｎｇ，邋Ｘ．，邋ｅＭ／．，邋２０１３）。逡逑Ｆｉｇ邋１－２．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｒａｐ２ｂ，邋ａ邋ｎｏｖｅｌ邋ｐ５３邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ．逡逑Ｒａｐ２ｂ基因共編碼１８３個氨基酸。屬于Ｒａｓ癌基因超家族，Ｒａｓ超家族小分子量ＧＴＰ逡逑結合蛋白的Ｒａｐ２亞家族（Ｔｏｒｔｉ，邋Ｍ．邋ａｎｄＬａｐｅｔｉｎａ，邋Ｅ．邋Ｇ．，邋１９９４）。Ｒａｐ２家族共包含三個成員：逡逑Ｒａｐ２ａ、Ｒａｐ２ｂ和Ｒａｐ２ｃ，三種蛋白序列具有高度同源性（見圖１－４）。Ｒａｐ２ｂ蛋白在進化逡逑上局度保守

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本文編號：2731453