【摘要】：RAS相關(guān)蛋白家族成員Rap2b是一種新發(fā)現(xiàn)的p53下游靶基因。當(dāng)p53+/+細(xì)胞受到外源性刺激時(shí)(如阿霉素給藥),p53被激活,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Rap2b蛋白的表達(dá)量顯著增加,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。我們推測(cè),Rap2b是一個(gè)有效的腫瘤治療靶點(diǎn)。為此,本文設(shè)計(jì)了一種以納米材料為載體的藥物/基因遞送系統(tǒng),用于評(píng)估Rap2b siRNA作為一種抗腫瘤治療藥物的潛力。同時(shí)本文通過(guò)研究Rap2b與p53之間的相互作用,為闡明Rap2bsiRNA的抗腫瘤機(jī)制提供重要線索。首先,為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn),我們制備了 Rap2b單克隆抗體。共得到八個(gè)單克隆抗體穩(wěn)定細(xì)胞株。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示八株均為IgG1類抗體。同時(shí)免疫印跡法結(jié)果顯示抗體的最低使用濃度為0.1 μg/mL,所能檢測(cè)到的蛋白最低量為5 ng。然后,我們通過(guò)氯金酸法合成了金納米殼顆粒,并將合成的Rap2bsiRNA和阿霉素連接到金納米殼上。納米粒子與HCT116細(xì)胞共孵育后,在熒光顯微鏡下可見(jiàn)裝載有阿霉素和Rap2b siRNA的金納米殼被腫瘤細(xì)胞吸收。激光照射能顯著促進(jìn)金納米殼釋放阿霉素和Rap2b siRNA,而且釋放的Rap2b siRNA能顯著降低細(xì)胞內(nèi)Rap2b的表達(dá)水平。接著,我們通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了不同藥物聯(lián)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果顯示,降低Rap2b的表達(dá)水平能顯著增強(qiáng)阿霉素對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。同時(shí),激光照射納米粒子產(chǎn)生的熱能能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生額外的殺傷作用,進(jìn)一步提高了阿霉素的腫瘤治療效果。最后,我們通過(guò)體外GST pulldown實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了 Rap2b與p53之間存在直接相互作用。為了確定這兩種蛋白互作的結(jié)構(gòu)域,我們構(gòu)建了一系列Rap2b和p53的截短突變體,再通過(guò)體外GSTpullldown實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定了 Rap2b的第41-135位氨基酸殘基和p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是二者直接相互作用的區(qū)域。綜上所述,本研究證明了 Rap2b siRNA能顯著增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤療效,而且Rap2b能與p53直接結(jié)合,推測(cè)Rap2b可能通過(guò)與p53直接結(jié)合而負(fù)反饋調(diào)控p53的活性。這些發(fā)現(xiàn)有助于深入理解Rap2b和p53在腫瘤發(fā)生發(fā)展和耐藥性形成中的作用,為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新靶點(diǎn),對(duì)于惡性腫瘤的防治具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.5
【圖文】：

后根據(jù)細(xì)胞類型和脅迫類型的不同，活化的ｐ５３可通過(guò)激活下游不同的靶基因進(jìn)而誘導(dǎo)不逡逑同的生物學(xué)效應(yīng)，例如細(xì)胞周期阻滯、ＤＮＡ修復(fù)、細(xì)胞凋亡以及抗血管生成和細(xì)胞衰老（見(jiàn)逡逑圖１－１）等，從而表現(xiàn)出腫瘤抑制作用。近年來(lái)也有研究表明ｐ５３在干細(xì)胞分化過(guò)程中具逡逑有重要作用（Ｌｅｅ邋Ｋ．邋Ｈ．，ｅｆ邋ａ人，２０１０；邋Ｊｏｅｒｇｅｒ邋Ａ．邋Ｃ．邋ａｎｄ邋Ａ．邋Ｒ．邋Ｆｅｒｓｈｔ．，邋２００８；邋Ｚｈａｎｇ，邋Ｘ．，ｅｆ邋ａ／，逡逑２０１３）。因此，篩選并鑒定ｐ５３的祀基因，同時(shí)研宄這些靶基因的功能及其分子機(jī)制對(duì)于全逡逑面而深入的了解ｐ５３的功能，尤其是ｐ５３在腫瘠發(fā)生、發(fā)展中的作用以及尋找新的腫瘤治逡逑療靶點(diǎn)等方面都具有非常重要的意義。逡逑

逑在之前的研究中，研究者們利用基因芯片技術(shù)結(jié)合ＣＨ［Ｐ－ｃｈｉｐ技術(shù)在基因組水平篩選逡逑ｐ５３靶基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有促腫瘤細(xì)胞生存功能的新靶基因ＲａＰ２ｂ邋（見(jiàn)圖１－２）邋（Ｚｈａｎｇ，逡逑Ｘ．，邋ｅｔ邋ａ／．，２０１３）0逡逑Ａ邋Ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｅｎｅ邐ｐ５３邋ｃｈｒｏｍａｔｉｎ邋ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｃｈａｎｇｅ，邋ｐ＜０．００１逡逑ＭＥＦ邐ｍＥＳ邐ＭＥＦ邐ｍＥＳ逡逑＾＾３邐２９７０＾＾邋２４２逡逑ｂｉｎｄｉｎｇ逡逑Ｉ邋—邋Ａｌｏｘ５逡逑—Ｅｄａ２ｒ逡逑－Ｂｔｇ２逡逑－Ｍｄｍ２逡逑—Ａｄｒｂ２逡逑—Ｃｄｋｎｌａ逡逑－ＴｎｆｒｓｆｌＯｂ逡逑—Ｒａｐ２ｂ逡逑－Ｂｂｃ３逡逑圖１－２．邋ｐ５３新靶基因Ｒａｐ２ｂ的篩選示意圖（Ｚｈａｎｇ，邋Ｘ．，邋ｅＭ／．，邋２０１３）。逡逑Ｆｉｇ邋１－２．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｒａｐ２ｂ，邋ａ邋ｎｏｖｅｌ邋ｐ５３邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ．逡逑Ｒａｐ２ｂ基因共編碼１８３個(gè)氨基酸。屬于Ｒａｓ癌基因超家族，Ｒａｓ超家族小分子量ＧＴＰ逡逑結(jié)合蛋白的Ｒａｐ２亞家族（Ｔｏｒｔｉ，邋Ｍ．邋ａｎｄＬａｐｅｔｉｎａ，邋Ｅ．邋Ｇ．，邋１９９４）。Ｒａｐ２家族共包含三個(gè)成員：逡逑Ｒａｐ２ａ、Ｒａｐ２ｂ和Ｒａｐ２ｃ，三種蛋白序列具有高度同源性（見(jiàn)圖１－４）。Ｒａｐ２ｂ蛋白在進(jìn)化逡逑上局度保守

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本文編號(hào)：2731453