發(fā)布時間：2020-06-26 01:00

【摘要】：第一部分:KIF15在胰腺癌組織中的表達及臨床意義目的:篩選胰腺癌潛在的基因治療靶點,并擴大樣本量在胰腺癌患者組織中進行檢測,探討KIF15在胰腺癌組織中的表達及臨床意義。方法:采用Agilent m RNA表達譜基因芯片(m RNA microarray)分析7例胰腺癌組織及健康對照組織中差異表達的m RNA;從基因芯片中選取了22個表達差異明顯的m RNA,通過高含量si RNA篩選(high-content si RNA screening)驗證基因芯片的結(jié)果并驗證其功能;免疫組織化學檢測90例胰腺癌及相應癌旁正常胰腺組織中KIF15的表達,并分析KIF15的表達量與臨床病理、臨床分期以及預后關(guān)系;實時熒光定量聚合酶鏈反應(q RT-PCR)檢測27例胰腺癌及相應癌旁正常胰腺組織中KIF15的表達。結(jié)果:1.m RNA基因芯片顯示差異表達的基因有1460個,其中胰腺癌患者組織中高表達的有892個,低表達的有568個;2.高含量si RNA篩選顯示通過干擾22個表達差異明顯的m RNA,其中有四個基因(KIF15、FAM54A、GMFB、ZWINT)能有效抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖,并且KIF15的效果最佳;3.免疫組織化學顯示KIF15在胰腺癌組織中高表達(P0.05)且主要分布于胞質(zhì)中,而在對應的癌旁正常胰腺組織中KIF15低表達;KIF15的表達量與NCCN臨床分期的關(guān)系:臨床分期越高,KIF15的表達量越高(P0.05);KIF15的表達量與病理分期無統(tǒng)計學意義;KIF15的表達量與腫瘤是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.01)。KIF15在胰腺癌組織中的表達量與患者生存期呈負相關(guān)(P0.05);4.q RT-PCR顯示KIF15在胰腺癌組織中高表達(P0.001)。結(jié)論:KIF15在胰腺癌患者組織中高表達,且與預后不良相關(guān);KIF15可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展或者生物學效應中扮演重要角色,可以作為進一步研究對象。第二部分:KIF15對胰腺癌細胞增殖能力的影響目的:探討KIF15對胰腺癌細胞體內(nèi)、體外增殖能力的影響。方法:設(shè)計干擾KIF15表達的si RNA序列,構(gòu)建穩(wěn)定表達的KIF15過表達、抑制表達以及陰性對照慢病毒載體,并將si RNA和慢病毒載體分別轉(zhuǎn)(感)染胰腺癌PANC-1和MIA Pa Ca-2細胞,q RT-PCR檢測轉(zhuǎn)(感)染效率;Cell Counting Kit-8(CCK-8)實驗檢測KIF15對胰腺癌細胞增殖能力的影響;流式細胞術(shù)檢測KIF15對胰腺癌細胞周期及凋亡的影響;體內(nèi)建立裸鼠皮下成瘤模型,模擬體內(nèi)環(huán)境中KIF15對胰腺癌細胞裸鼠皮下成瘤能力的影響。免疫組化實驗檢測KIF15在瘤體內(nèi)對Ki67表達的影響。Western bolt檢測周期蛋白的表達。結(jié)果:成功設(shè)計si-KIF15序列并成功構(gòu)建慢病毒載體,CCK-8實驗結(jié)果顯示上調(diào)KIF15的表達可顯著促進胰腺癌細胞的增殖能力(P0.05),下調(diào)KIF15表達則顯著抑制胰腺癌細胞的增殖能力(P0.05);流式細胞術(shù)顯示,抑制KIF15表達使胰腺癌細胞周期阻滯在G1期(P0.05);而KIF15的表達對胰腺癌細胞凋亡無明顯影響,差異無統(tǒng)計學意義;裸鼠皮下成瘤實驗顯示,下調(diào)KIF15的表達能顯著抑制胰腺癌細胞裸鼠皮下成瘤的能力(P0.05);免疫組化顯示,下調(diào)KIF15的表達能抑制Ki67的表達。Western bolt結(jié)果顯示:KIF15能促進周期蛋白cyclin D1、CDK2、P-RB等表達上調(diào),導致G1/S期轉(zhuǎn)換,而下調(diào)KIF15則抑制上訴蛋白的表達,使細胞阻滯在G1期。結(jié)論:KIF15能促進胰腺癌細胞的增殖,下調(diào)KIF15能抑制胰腺癌細胞的皮下成瘤能力,其抑制作用可能部分是通過阻滯胰腺癌細胞周期處于G1期而實現(xiàn)的。第三部分:KIF15對胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目的:探討KIF15對胰腺癌細胞體內(nèi)、體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法:在體外,采用transwell侵襲、遷移實驗檢測KIF15對胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;免疫熒光實驗檢測細胞骨架蛋白的變化。在體內(nèi),建立裸鼠脾臟肝肺轉(zhuǎn)移模型,模擬KIF15在體內(nèi)環(huán)境中對胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。Western bolt檢測KIF15對基質(zhì)金屬蛋白酶表達的影響。結(jié)果:transwell侵襲、遷移實驗顯示上調(diào)KIF15表達,相對于陰性對照,能顯著促進胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,而下調(diào)KIF15表達,相對于陰性對照,則顯著抑制胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);免疫熒光實驗顯示,下調(diào)KIF15表達,細胞骨架蛋白F-actin被剪切,呈現(xiàn)低表達,喪失運動結(jié)構(gòu)和極性,而對照組細胞骨架蛋白F-actin未被剪切,呈現(xiàn)高表達,為細胞運動提供了必要的運動結(jié)構(gòu)和極性;裸鼠脾臟肝肺轉(zhuǎn)移模型顯示,過表達KIF15,能導致肝臟及肺臟轉(zhuǎn)移灶明顯多于陰性對照組(P0.05),且生存周期較陰性對照組明確縮短(P0.05),裸鼠體重較陰性對照組也明顯降低(P0.05),低表達KIF15,則能抑制胰腺癌細胞向肝臟及肺臟的轉(zhuǎn)移,延長裸鼠的生存周期,增加裸鼠的體重。過表達KIF15能促進MMP2、MMP14的表達.結(jié)論:KIF15能促進胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,且能促進裸鼠體內(nèi)胰腺癌細胞向肝、肺轉(zhuǎn)移的能力,縮短生存期,導致惡病質(zhì)的形成;下調(diào)KIF15表達,則侵襲轉(zhuǎn)移能力能被抑制,細胞骨架蛋白F-actin被剪切,不能為間充質(zhì)移動方式向阿米巴樣移動方式的轉(zhuǎn)變提供必要的運動結(jié)構(gòu)和極性,從而遷移能力變?nèi)?且下調(diào)KIF15表達后能改善裸鼠生存狀況,抑制裸鼠體內(nèi)胰腺癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移。KIF15能促進MMP2、MMP14的表達,有助于細胞外基質(zhì)的重塑,促進胰腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。第四部分:KIF15通過激活MEK-ERK信號通路調(diào)控胰腺癌細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移目的:探討KIF15促進胰腺癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制。方法:通過Agilent m RNA基因芯片分析3對胰腺癌KIF15基因敲除細胞和陰性對照細胞差異表達的m RNA,發(fā)現(xiàn)當敲除KIF15基因,MEK-ERK信號通路中的多個關(guān)鍵基因的m RNA水平均下調(diào),另外通過網(wǎng)絡(luò)調(diào)控信號通路分析MEK-ERK信號通路與KIF15聯(lián)系最為密切,故初步確定KIF15參與激活MEK-ERK信號通路;Western bolt實驗檢測KIF15對MEK-ERK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響;免疫熒光實驗檢測KIF15與MEK-ERK信號通路關(guān)鍵蛋白共定位情況以及P-ERK入核情況;免疫共沉淀實驗檢測KIF15與MEK-ERK信號通路關(guān)鍵蛋白相互作用的情況;應用MEK-ERK信號通路阻滯劑(PD98059、U0126、AZD6244)觀察生物學效應是否改變,通路相關(guān)蛋白及下游靶蛋白表達水平是否改變;建立裸鼠肝肺轉(zhuǎn)移模型,應用PD98059阻滯劑后,檢測裸鼠生存狀況及肝肺轉(zhuǎn)移灶情況。結(jié)果:Western bolt結(jié)果顯示,上調(diào)KIF15表達,能促進MEK-ERK信號通路關(guān)鍵蛋白P-c-Raf、P-MEK、P-ERK等表達上調(diào),下調(diào)KIF15表達則上訴結(jié)果下調(diào);免疫共沉淀結(jié)果顯示KIF15與通路關(guān)鍵蛋白P-MEK、P-c-Raf有相互作用;免疫熒光結(jié)果顯示,KIF15與通路關(guān)鍵蛋白P-MEK、P-c-Raf有共定位現(xiàn)象,且干擾KIF15后KIF15、P-MEK、P-c-Raf的表達量均減少;下調(diào)KIF15表達,能抑制P-ERK從胞質(zhì)轉(zhuǎn)向胞核;應用通路阻滯劑后,過表達KIF15后的生物學效應被抑制,表達增高的通路相關(guān)蛋白及下游靶蛋白表達水平受到抑制,裸鼠肝肺轉(zhuǎn)移模型顯示,應用MEK-ERK通路阻滯劑PD98059后,過表達KIF15促進遠處轉(zhuǎn)移灶形成、縮短生存周期、降低生存狀況的情況得以改善。結(jié)論:KIF15能直接作用于P-c-Raf或者P-MEK,從而激活P-ERK,進而激活MEK-ERK信號通路;P-ERK入核促進cyclin D1、CDK2、P-RB等轉(zhuǎn)錄,使蛋白表達上調(diào),細胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變,從而促進細胞的增殖;P-ERK入核促進基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-14的轉(zhuǎn)錄,導致蛋白表達增高,使基質(zhì)降解加快,從而促進細胞的侵襲轉(zhuǎn)移;應用MEK-ERK信號通路阻滯劑后,KIF15的促進作用被抑制。
【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.9
【圖文】：

VEGFA 和 BIRC5 能促進胰腺癌的增殖[19, 20]（圖 1-2）；4 個候選基因IF15 以后，抑制效果最明顯（圖 1-3）。結(jié)合相關(guān)文獻及前期基礎(chǔ)工擇 KIF15 作為研究對象。

圖 1-1 Agilent mRNA 芯片表達圖譜Fig.1-1 Difference mRNA expression in Agilent mRNA microarray

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王杰;喻超;周顯飛;蔡坤;何志偉;江建新;;miRNA-1181通過抑制STAT3影響人胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[J];貴州醫(yī)科大學學報;2016年12期

2 王亮;楊豐源;陳慧怡;潘俊敏;;微管解聚驅(qū)動蛋白Kinesin-13的研究進展與展望[J];科學通報;2015年20期

3 潘章;陳靜;耿軼釗;張輝;覃靜宇;紀青;;驅(qū)動蛋白的研究進展[J];生命科學研究;2012年04期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 喻超;Hsa-microRNA-138-5p靶向調(diào)控FOXC1和Vimentin抑制胰腺癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[D];貴陽醫(yī)學院;2015年

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1 胡曉晴;染色體驅(qū)動蛋白KIF4A通過與細胞膜蛋白supervillin的相互作用影響胃癌細胞的遷移侵襲[D];天津師范大學;2016年

本文編號：2729584