【摘要】：第一部分:KIF15在胰腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義目的:篩選胰腺癌潛在的基因治療靶點(diǎn),并擴(kuò)大樣本量在胰腺癌患者組織中進(jìn)行檢測,探討KIF15在胰腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法:采用Agilent m RNA表達(dá)譜基因芯片(m RNA microarray)分析7例胰腺癌組織及健康對照組織中差異表達(dá)的m RNA;從基因芯片中選取了22個(gè)表達(dá)差異明顯的m RNA,通過高含量si RNA篩選(high-content si RNA screening)驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果并驗(yàn)證其功能;免疫組織化學(xué)檢測90例胰腺癌及相應(yīng)癌旁正常胰腺組織中KIF15的表達(dá),并分析KIF15的表達(dá)量與臨床病理、臨床分期以及預(yù)后關(guān)系;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(q RT-PCR)檢測27例胰腺癌及相應(yīng)癌旁正常胰腺組織中KIF15的表達(dá)。結(jié)果:1.m RNA基因芯片顯示差異表達(dá)的基因有1460個(gè),其中胰腺癌患者組織中高表達(dá)的有892個(gè),低表達(dá)的有568個(gè);2.高含量si RNA篩選顯示通過干擾22個(gè)表達(dá)差異明顯的m RNA,其中有四個(gè)基因(KIF15、FAM54A、GMFB、ZWINT)能有效抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖,并且KIF15的效果最佳;3.免疫組織化學(xué)顯示KIF15在胰腺癌組織中高表達(dá)(P0.05)且主要分布于胞質(zhì)中,而在對應(yīng)的癌旁正常胰腺組織中KIF15低表達(dá);KIF15的表達(dá)量與NCCN臨床分期的關(guān)系:臨床分期越高,KIF15的表達(dá)量越高(P0.05);KIF15的表達(dá)量與病理分期無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;KIF15的表達(dá)量與腫瘤是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.01)。KIF15在胰腺癌組織中的表達(dá)量與患者生存期呈負(fù)相關(guān)(P0.05);4.q RT-PCR顯示KIF15在胰腺癌組織中高表達(dá)(P0.001)。結(jié)論:KIF15在胰腺癌患者組織中高表達(dá),且與預(yù)后不良相關(guān);KIF15可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展或者生物學(xué)效應(yīng)中扮演重要角色,可以作為進(jìn)一步研究對象。第二部分:KIF15對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響目的:探討KIF15對胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)、體外增殖能力的影響。方法:設(shè)計(jì)干擾KIF15表達(dá)的si RNA序列,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的KIF15過表達(dá)、抑制表達(dá)以及陰性對照慢病毒載體,并將si RNA和慢病毒載體分別轉(zhuǎn)(感)染胰腺癌PANC-1和MIA Pa Ca-2細(xì)胞,q RT-PCR檢測轉(zhuǎn)(感)染效率;Cell Counting Kit-8(CCK-8)實(shí)驗(yàn)檢測KIF15對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測KIF15對胰腺癌細(xì)胞周期及凋亡的影響;體內(nèi)建立裸鼠皮下成瘤模型,模擬體內(nèi)環(huán)境中KIF15對胰腺癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力的影響。免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測KIF15在瘤體內(nèi)對Ki67表達(dá)的影響。Western bolt檢測周期蛋白的表達(dá)。結(jié)果:成功設(shè)計(jì)si-KIF15序列并成功構(gòu)建慢病毒載體,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)KIF15的表達(dá)可顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖能力(P0.05),下調(diào)KIF15表達(dá)則顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力(P0.05);流式細(xì)胞術(shù)顯示,抑制KIF15表達(dá)使胰腺癌細(xì)胞周期阻滯在G1期(P0.05);而KIF15的表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞凋亡無明顯影響,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示,下調(diào)KIF15的表達(dá)能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤的能力(P0.05);免疫組化顯示,下調(diào)KIF15的表達(dá)能抑制Ki67的表達(dá)。Western bolt結(jié)果顯示:KIF15能促進(jìn)周期蛋白cyclin D1、CDK2、P-RB等表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致G1/S期轉(zhuǎn)換,而下調(diào)KIF15則抑制上訴蛋白的表達(dá),使細(xì)胞阻滯在G1期。結(jié)論:KIF15能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖,下調(diào)KIF15能抑制胰腺癌細(xì)胞的皮下成瘤能力,其抑制作用可能部分是通過阻滯胰腺癌細(xì)胞周期處于G1期而實(shí)現(xiàn)的。第三部分:KIF15對胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目的:探討KIF15對胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)、體外侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。方法:在體外,采用transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)檢測KIF15對胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞骨架蛋白的變化。在體內(nèi),建立裸鼠脾臟肝肺轉(zhuǎn)移模型,模擬KIF15在體內(nèi)環(huán)境中對胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。Western bolt檢測KIF15對基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響。結(jié)果:transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)顯示上調(diào)KIF15表達(dá),相對于陰性對照,能顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,而下調(diào)KIF15表達(dá),相對于陰性對照,則顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,下調(diào)KIF15表達(dá),細(xì)胞骨架蛋白F-actin被剪切,呈現(xiàn)低表達(dá),喪失運(yùn)動結(jié)構(gòu)和極性,而對照組細(xì)胞骨架蛋白F-actin未被剪切,呈現(xiàn)高表達(dá),為細(xì)胞運(yùn)動提供了必要的運(yùn)動結(jié)構(gòu)和極性;裸鼠脾臟肝肺轉(zhuǎn)移模型顯示,過表達(dá)KIF15,能導(dǎo)致肝臟及肺臟轉(zhuǎn)移灶明顯多于陰性對照組(P0.05),且生存周期較陰性對照組明確縮短(P0.05),裸鼠體重較陰性對照組也明顯降低(P0.05),低表達(dá)KIF15,則能抑制胰腺癌細(xì)胞向肝臟及肺臟的轉(zhuǎn)移,延長裸鼠的生存周期,增加裸鼠的體重。過表達(dá)KIF15能促進(jìn)MMP2、MMP14的表達(dá).結(jié)論:KIF15能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,且能促進(jìn)裸鼠體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞向肝、肺轉(zhuǎn)移的能力,縮短生存期,導(dǎo)致惡病質(zhì)的形成;下調(diào)KIF15表達(dá),則侵襲轉(zhuǎn)移能力能被抑制,細(xì)胞骨架蛋白F-actin被剪切,不能為間充質(zhì)移動方式向阿米巴樣移動方式的轉(zhuǎn)變提供必要的運(yùn)動結(jié)構(gòu)和極性,從而遷移能力變?nèi)?且下調(diào)KIF15表達(dá)后能改善裸鼠生存狀況,抑制裸鼠體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。KIF15能促進(jìn)MMP2、MMP14的表達(dá),有助于細(xì)胞外基質(zhì)的重塑,促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。第四部分:KIF15通過激活MEK-ERK信號通路調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移目的:探討KIF15促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。方法:通過Agilent m RNA基因芯片分析3對胰腺癌KIF15基因敲除細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞差異表達(dá)的m RNA,發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除KIF15基因,MEK-ERK信號通路中的多個(gè)關(guān)鍵基因的m RNA水平均下調(diào),另外通過網(wǎng)絡(luò)調(diào)控信號通路分析MEK-ERK信號通路與KIF15聯(lián)系最為密切,故初步確定KIF15參與激活MEK-ERK信號通路;Western bolt實(shí)驗(yàn)檢測KIF15對MEK-ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測KIF15與MEK-ERK信號通路關(guān)鍵蛋白共定位情況以及P-ERK入核情況;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測KIF15與MEK-ERK信號通路關(guān)鍵蛋白相互作用的情況;應(yīng)用MEK-ERK信號通路阻滯劑(PD98059、U0126、AZD6244)觀察生物學(xué)效應(yīng)是否改變,通路相關(guān)蛋白及下游靶蛋白表達(dá)水平是否改變;建立裸鼠肝肺轉(zhuǎn)移模型,應(yīng)用PD98059阻滯劑后,檢測裸鼠生存狀況及肝肺轉(zhuǎn)移灶情況。結(jié)果:Western bolt結(jié)果顯示,上調(diào)KIF15表達(dá),能促進(jìn)MEK-ERK信號通路關(guān)鍵蛋白P-c-Raf、P-MEK、P-ERK等表達(dá)上調(diào),下調(diào)KIF15表達(dá)則上訴結(jié)果下調(diào);免疫共沉淀結(jié)果顯示KIF15與通路關(guān)鍵蛋白P-MEK、P-c-Raf有相互作用;免疫熒光結(jié)果顯示,KIF15與通路關(guān)鍵蛋白P-MEK、P-c-Raf有共定位現(xiàn)象,且干擾KIF15后KIF15、P-MEK、P-c-Raf的表達(dá)量均減少;下調(diào)KIF15表達(dá),能抑制P-ERK從胞質(zhì)轉(zhuǎn)向胞核;應(yīng)用通路阻滯劑后,過表達(dá)KIF15后的生物學(xué)效應(yīng)被抑制,表達(dá)增高的通路相關(guān)蛋白及下游靶蛋白表達(dá)水平受到抑制,裸鼠肝肺轉(zhuǎn)移模型顯示,應(yīng)用MEK-ERK通路阻滯劑PD98059后,過表達(dá)KIF15促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶形成、縮短生存周期、降低生存狀況的情況得以改善。結(jié)論:KIF15能直接作用于P-c-Raf或者P-MEK,從而激活P-ERK,進(jìn)而激活MEK-ERK信號通路;P-ERK入核促進(jìn)cyclin D1、CDK2、P-RB等轉(zhuǎn)錄,使蛋白表達(dá)上調(diào),細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變,從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖;P-ERK入核促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-14的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致蛋白表達(dá)增高,使基質(zhì)降解加快,從而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移;應(yīng)用MEK-ERK信號通路阻滯劑后,KIF15的促進(jìn)作用被抑制。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.9
【圖文】：

VEGFA 和 BIRC5 能促進(jìn)胰腺癌的增殖[19, 20]（圖 1-2）；4 個(gè)候選基因IF15 以后，抑制效果最明顯（圖 1-3）。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及前期基礎(chǔ)工擇 KIF15 作為研究對象。

圖 1-1 Agilent mRNA 芯片表達(dá)圖譜Fig.1-1 Difference mRNA expression in Agilent mRNA microarray

【參考文獻(xiàn)】

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2 王亮;楊豐源;陳慧怡;潘俊敏;;微管解聚驅(qū)動蛋白Kinesin-13的研究進(jìn)展與展望[J];科學(xué)通報(bào);2015年20期

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本文編號：2729584