【摘要】：背景:乳腺癌是目前全世界女性最常見的惡性腫瘤之一。雖然當今乳腺癌的診斷及綜合治療策略包括手術、放療、化療、內分泌治療、靶向治療、免疫治療等正日益突飛猛進,乳腺癌的臨床療效明顯提高,然而乳腺癌的局部復發(fā)和遠處轉移仍頻繁發(fā)生,導致部分乳腺癌患者預后較差。明確乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉移、侵襲、增殖、耐藥等生物學特征的相關因素和作用機制,探索乳腺癌新的治療靶點和治療方法仍然迫在眉睫。婆羅雙樹樣基因4(Sal-Like 4,SALL4)是近年發(fā)現(xiàn)的原癌基因,位于人類20號染色體20q13.13-q13.2區(qū)域,可以編碼SALL4A、SALL4B和SALL4C三種異構體蛋白。SALL4在胚胎的早期發(fā)育、器官形成以及胚胎干細胞增殖、多能性維持和自我更新方面均發(fā)揮著重要的作用,且與遺傳性疾病、白血病、淋巴瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展存在相關性。越來越多的證據(jù)表明SALL4在多種腫瘤中高表達,如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、結直腸癌、腎母細胞瘤、子宮內膜癌、和生殖細胞瘤等,并且在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。近年來,國內外文獻對SALL4的結構、功能、生物學特征、與非腫瘤及腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展的關系等已有多方面報道,其中較多的是研究SALL4與造血系統(tǒng)、先天性疾病、生殖細胞腫瘤等疾病的關系,對其與乳腺癌關系的研究仍然比較缺乏,SALL4在乳腺癌中扮演的角色尚未被闡明。本實驗旨在研究SALL4與乳腺癌生物學行為的相關性及其影響乳腺癌阿霉素耐藥性的機制。方法:1、通過RT-PCR、Western blot檢測30對乳腺癌組織及其配對癌旁組織中SALL4的表達差異;選取75例患者的乳腺癌組織,通過免疫組織化學方法檢測乳腺癌中SALL4表達水平與臨床病理學參數(shù)之間的關系。2、構建沉默SALL4的乳腺癌細胞系,通過平板克隆形成實驗、MTT法、CCK-8法和裸鼠體內成瘤實驗檢測SALL4對乳腺癌細胞增殖活性的影響;通過流式細胞儀及Western blot檢測SALL4對乳腺癌細胞凋亡比例及凋亡相關蛋白表達的影響;通過流式細胞儀及Western blot檢測SALL4對乳腺癌細胞周期及周期相關蛋白表達的影響;通過細胞劃痕實驗檢測SALL4對乳腺癌細胞遷移能力的影響;通過Transwell小室實驗檢測SALL4對乳腺癌細胞侵襲能力的影響;通過MTT法檢測SALL4對乳腺癌細胞阿霉素耐藥性的影響。3、通過Western blot法檢測沉默SALL4基因后MCF-7細胞中PTEN、Notch1、Wnt3a的表達量,篩選SALL4可能調節(jié)的耐藥通路。構建沉默SALL4的shSALL4-MCF-7/ADR細胞株。阿霉素處理MCF-7,MCF-7/ADR,shSALL4-MCF-7/ADR后,MTT法檢測SALL4對細胞增殖活性及IC50的影響,流式細胞儀檢測SALL4對細胞凋亡情況及胞內阿霉素含量的影響;RT-PCR和Western blot檢測SALL4對耐藥基因ABCB1、ABCG2、c-myc表達的影響;RT-PCR和Western blot檢測SALL4對PTEN表達的影響;Western blot檢測SALL4對p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR表達的影響。在阿霉素處理的MCF-7/ADR、shSALL4-MCF-7/ADR兩組細胞中,流式細胞儀檢測加入PTEN抑制劑后SALL4影響細胞凋亡比例的變化;Western blot檢測加入PTEN抑制劑后SALL4影響ABCB1、ABCG2、c-myc表達量的變化。結果:1、SALL4在乳腺癌組織中的表達量明顯高于與其配對的癌旁組織。在臨床病理資料統(tǒng)計中,SALL4高表達組淋巴結轉移例數(shù)明顯高于SALL4低表達組,而SALL4與年齡、病理類型、組織學分級、腫瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67表達水平無明顯相關,其中SALL4陽性組腫瘤大小均值較陰性組有增加的趨勢。2、在MDA-MB-435、MDA-MB-468、MCF-7細胞系中成功構建沉默SALL4的乳腺癌細胞系。沉默SALL4可以明顯抑制乳腺癌細胞的增殖活性,抑制裸鼠體內腫瘤的生長;明顯降低乳腺癌細胞S期細胞比例,增加G1期細胞比例,促進乳腺癌細胞停滯于G1期,阻滯細胞周期進展;沉默SALL4后乳腺癌細胞的凋亡比例明顯增加,侵襲和遷移能力明顯降低,對阿霉素的耐藥性明顯降低。3、成功構建沉默SALL4的乳腺癌耐藥細胞系shSALL4-MCF-7/ADR,驗證SALL4在MCF-7/ADR中的表達量明顯高于MCF-7、shSALL4-MCF-7/ADR。在阿霉素處理的細胞中沉默SALL4,各組細胞的IC50降低,凋亡率顯著上升,胞內阿霉素含量顯著上升,ABCB1、ABCG2、c-myc表達量明顯下降。沉默SALL4后各組細胞PTEN表達量明顯上升,p-AKT、p-mTOR表達量明顯下降。shSALL4-MCF-7/ADR細胞的凋亡比例較MCF-7/ADR細胞明顯上升,耐藥基因ABCB1、ABCG2、c-myc表達量明顯下降;加入PTEN抑制劑后shSALL4-MCF-7/ADR細胞的凋亡比例無明顯上升,ABCB1、ABCG2、c-myc表達量無明顯下降。結論:SALL4在乳腺癌組織中的表達量較癌旁組織高,與淋巴結轉移明顯相關;沉默SALL4可以明顯抑制乳腺癌細胞的增殖活性,增加乳腺癌細胞的凋亡,阻滯細胞周期進展,抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移,降低乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性;SALL4在MCF-7細胞中可以通過PTEN/AKT/mTOR通路影響乳腺癌細胞的阿霉素耐藥性。本研究對深入了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了新的理論依據(jù),為乳腺癌的治療提供可能的新的治療靶點。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

圖 1 SALL4 在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達。A：Western blot 驗證 SALL4 的表達；B：RT-PCR 驗證 SALL4 mRNA 的表達。3.2 SALL4 表達水平與臨床病理特征的相關性免疫組織化學(SP)法檢測 SALL4 在乳腺癌組織中的表達。圖 2A 為 SALL4高表達的乳腺癌組織，圖 2B 為 SALL4 低表達的乳腺癌組織，并按照免疫組織化學染色評分標準將其分為SALL4 高表達組(n=26)與SALL4 低表達組(n=49)(圖2)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn) SALL4 高表達組淋巴結轉移例數(shù)明顯高于 SALL4 低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；而與患者的年齡、病理類型、組織學分級、腫瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67 表達水平無明顯相關(p>0.05)。其中 SALL4 陽性組腫瘤大小均值(4.337±3.385cm)較 SALL4 陰性組腫瘤大小均值(3.919±2.690cm)大，

鄡浞治sALL4 高表達組(n=26)與SALL4 低表達組(n=49)(圖2)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn) SALL4 高表達組淋巴結轉移例數(shù)明顯高于 SALL4 低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；而與患者的年齡、病理類型、組織學分級、腫瘤大小、ER、PR、Her-2、Ki67 表達水平無明顯相關(p>0.05)。其中 SALL4 陽性組腫瘤大小均值(4.337±3.385cm)較 SALL4 陰性組腫瘤大小均值(3.919±2.690cm)大，

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