【摘要】：目的:惡性腫瘤已成為當(dāng)今人類健康的主要威脅,隨著新的治療方法出現(xiàn),新的問題也層出不窮。腫瘤發(fā)生的機(jī)制,耐藥及新的抗腫瘤藥物開發(fā)的問題亟待解決。缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible facto1,HIF1)其活性亞基HIF1α具有強(qiáng)大的功能,前期我們通過紅外質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIF1α與GA6存在相互作用,GA6作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白還未有報(bào)到與HIF1α有相互作用。本實(shí)驗(yàn)研究包括:GA6與HIF1α的相互作用及作用位點(diǎn),從體外細(xì)胞到體內(nèi)組織水平對(duì)GA6腫瘤生物學(xué)功能以及糖酵解關(guān)鍵酶的影響,以及與耐藥存在的關(guān)系。將為惡性腫瘤的輔助治療提供新的方向。方法:為了探究GA6與HIF1的關(guān)系我們通過構(gòu)建可表達(dá)GA6和HIF1α的表達(dá)載體,并導(dǎo)入293T細(xì)胞內(nèi)行免疫共沉淀確定其相互作用;純化GA6截短突變體所表達(dá)的GST融合蛋白與HIF1a行GST pulldown實(shí)驗(yàn),確定HIF1α在GA6上的結(jié)合情況;接下來在癌癥細(xì)胞株中,利用Western blot檢測其在GA6對(duì)HIF1α和糖酵解關(guān)鍵酶在蛋白水平上相互影響的關(guān)系,利用RT-PCR檢測在GA6對(duì)HIF1α和糖酵解關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄水平上相互影響的關(guān)系,并利用小鼠在體內(nèi)水平重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。最后通過培育的耐培美曲塞A549耐藥株,探索GA6與耐藥的關(guān)系。結(jié)果:通過免疫共沉淀確認(rèn)GA6與HIF1α存在相互作用,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HIF1α與GA6結(jié)合于其542-731段。通過敲低和過表達(dá)發(fā)現(xiàn)GA6可在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)促進(jìn)HIF1α的表達(dá),并在基因敲除鼠體內(nèi)得到認(rèn)證。GA6具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長調(diào)控糖酵解關(guān)鍵酶的生物學(xué)功能,與RAS的相互作用向我們展示了其與耐藥有關(guān)的可能。結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了 一個(gè)新的腫瘤細(xì)胞糖代謝調(diào)節(jié)因子——GA6,。GA6具有從轉(zhuǎn)錄,翻譯,及生物學(xué)活性等方面調(diào)節(jié)糖酵解關(guān)鍵酶的功能,因其具有調(diào)節(jié)HIF1α的能力,其調(diào)節(jié)腫瘤糖代謝可能通過此途徑完成。通過與K-RASG12D的結(jié)合增強(qiáng)展現(xiàn)了 GA6與耐藥的相關(guān)性。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.2
【圖文】：

ＧＡ６真核表達(dá)載體，將這兩種構(gòu)建成功的表達(dá)載體（質(zhì)粒）在２９３Ｔ細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染，逡逑轉(zhuǎn)染后２天收集細(xì)胞，鑒定轉(zhuǎn)染成功后，利用免疫共沉實(shí)驗(yàn)對(duì)上述收集的細(xì)胞進(jìn)行檢逡逑測，發(fā)現(xiàn)ＧＡ６與ＨＩＦ－ｌａ發(fā)生特異性結(jié)合（圖１．１）。由此說明，ＧＡ６是能與ＨＩＦ－ｌａ逡逑發(fā)生相互作用的蛋白。逡逑Ｍｙｃ－ＨＩＦｌａ邐＋邐＋逡逑ＦＬＡＧ－ＧＡ６邐－邐＋逡逑ＩＰ：邋ＦＬＡＧ逡逑ＩＢ：Ｍｙｃ逡逑Ｉｎｐｕｔ逡逑ＩＢ：Ｍｙｃ逡逑Ｉｎｐｕｔ逡逑ＩＢ：ＦＬＡＧ邋ｓ逡逑ｆ＊逡逑ＩＰ：ＦＬＡＧ邐毫灥＿逡逑ＩＢ：ＦＬＡＧ逡逑圖１．１免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)ＧＡ６與ＨＩＦ－ｌａ發(fā)生相互作用逡逑２８逡逑

解放軍醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文逡逑圖１．１免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)ＧＡ６與ＨＩＦ－ｌａ發(fā)生相互作用逡逑１．２邐檢測ＨＩＦ－１邋ａ與ＧＡ６的相互作用結(jié)構(gòu)域確定逡逑通過構(gòu)建帶有ＧＳＴ標(biāo)簽的ＧＡ６的截?cái)嗤蛔凅wＧＳＴ－ＧＡ６邋（１－１００）邋．邋ＧＳＴ－ＧＡ６逡逑（１０１－２２０）邋，ＧＳＴ－ＧＡ６邋（２２１－３６１）邋，ＧＳＴ－ＧＡ６邋（３６２－５４１），ＧＳＴ－ＧＡ６邋（５４２－７３１），將帶逡逑有Ｍｙｃ－ＨＩＦｌａ的真核表達(dá)載體與上述截短突變體在２９３Ｔ細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染，收取細(xì)胞，逡逑鑒定轉(zhuǎn)染成功后，以及小量誘導(dǎo)蛋白成功表達(dá)后，提取蛋白細(xì)胞裂解產(chǎn)物，利用半逡逑ｐｕｌｌｄｏｗｎ的實(shí)驗(yàn)方法，分析二者結(jié)合情況，其結(jié)果顯７Ｋ邋ＨＩＦ－ｌａ與ＧＡ６相互作用結(jié)構(gòu)逡逑域位于ＧＡ６的第５４２－７３１位氨基酸（圖１．２）。逡逑ＩＰ邋：邋ＧＳＴ逡逑ＩＢ邋：邋Ｍｙｃ邐蝴＿？．逡逑ＭＷ（ｋＤａ）９0Ｂ逡逑５５－１逡逑圖１．２半ｐｕｌｌｄｏｗｎ結(jié)果顯示ＨＩＦ－ｌａ與ＧＡ６相互作用于ＧＡ６邋（５４２－７３１）逡逑１．３邐ＧＡ６在蛋白表達(dá)水平對(duì)ＨＩＦ１邋ａ有調(diào)控作用逡逑在上述實(shí)驗(yàn)中，我們己經(jīng)確定了邋ＧＡ６與ＨＩＦｌ邋ａ有相互作用以及二者相互作用的逡逑結(jié)構(gòu)域?yàn)椋牵粒兜牡冢担矗玻罚常蔽话被幔覀冇址謩e通過在２９３Ｔ細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入表達(dá)載逡逑體Ｆｌａｇ－ＧＡ６，和敲低轉(zhuǎn)染ｓｉＧＡ６后，對(duì)其表達(dá)的ＨＩＦ１邋ａ通過ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ進(jìn)行檢測，逡逑結(jié)果發(fā)現(xiàn)在２９３Ｔ細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入Ｆｌａｇ－ＧＡ６可以增加ＨＩＦ１邋ａ表達(dá)（圖１．３邋Ａ）；敲低逡逑ＧＡ６可以降低ＨＩＦｌａ表達(dá)（圖１．３Ｂ）。逡逑＜邐２９逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2729077