【摘要】：結(jié)直腸癌(Colorectalcancer,CRC)是人類主要惡性腫瘤之一。近年來隨著光纖、內(nèi)窺鏡等技術(shù)的發(fā)展,光動力療法(photodynamic therapy,PDT)在治療結(jié)直腸癌等腔隙腫瘤中得到廣泛應(yīng)用。但臨床治療時氧消耗和光敏劑水平的不匹配,使得PDT的療效不甚理想。舒緩型光動力療法(metronomic photodynamic therapy,mPDT)是指低劑量長時間光照射使氧耗與光敏劑更好地匹配,以提高腫瘤細胞的選擇性凋亡而優(yōu)化治療效果的PDT療法。目的:本文將通過研究ALA誘導(dǎo)的mPDT在體內(nèi)外對人直腸癌細胞的殺傷作用和殺傷機制,旨在為直腸癌治療尋求一種高效療法。方法:1.體外實驗:以人結(jié)直腸癌細胞系SW837為實驗對象,MTT法對比分析急性光動力療法(acute photodynamic therapy,aPDT)和 mPDT 在不同 ALA 濃度(0.125、0.25、0.5、1、2mM)、不同光功率密度(0.2、0.4、0.8mW/cm2)、不同光能量密度(2.5、5J/cm2)下對細胞存活率的影響;在相同能量密度下,評價aPDT和mPDT處理后不同時間點的細胞凋亡(Annexin V-FITC/PI雙染法)和自噬(Ad-GFP-LC3B試劑盒);同時透射電鏡觀察兩種PDT處理后3h和12h的細胞超微結(jié)構(gòu);Western Blot檢測凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達。2.體內(nèi)實驗:設(shè)計研制用于在體直腸癌mPDT治療的栓劑試劑盒(包括ALA栓劑和LED直腸栓光源),分析其對兔原位直腸腫瘤的殺傷效果。以ALA、36型半合成脂肪酸甘油酯和氮酮為原料制備ALA栓劑(10 wt%);以透明環(huán)氧樹脂封裝LED芯片和相應(yīng)的電路來構(gòu)成LED栓劑。將VX2細胞注射至兔直腸粘膜下層,建立原位腫瘤模型,腫瘤生長至1cm3左右時進行mPDT處理:ALA栓劑(0.8g)經(jīng)直腸給藥30min后以功率密度為20mW/cm2的LED栓劑照射1h;每天1次,連續(xù)治療3天。mPDT后第7天和第14天分別用磁共振成像檢測腫瘤生長情況,并于第14天檢測后處死動物取腫瘤組織,作HE和TUNEL染色分析。結(jié)果:1.相同能量密度下,mPDT引起的細胞死亡相比aPDT發(fā)生得更早,殺傷效率更高。mPDT和aPDT(5J/cm2)處理后3、6、12、24h的細胞存活率分別是:35.2%、32.4%、27.6%、31.6%vs.85.7%、71.1%、67.8%、42.1%;2.相比aPDT,mPDT在處理后早期即引起較高的細胞凋亡。mPDT和aPDT(5J/cm2)處理后3、6、12、24h的細胞凋亡率分別是43.2%、47.3%、54.7%、50.3%vs.14.6%、17.6%、27.1%、53.2%。與 aPDT 處理組相比,mPDT 處理組中cleaved caspase-3和cleaved PARP的表達在處理后3h和6h顯著高,分別為2.45、5.83 倍(3h)和 2.47、1.21 倍(6h)。3.相比aPDT,mPDT引起更早的細胞自噬。mPDT處理后3h,細胞自噬達到峰值(20%),aPDT處理后3h和12h時,分別出現(xiàn)相對小的自噬峰(自噬率為14.1%和15.8%)。TEM結(jié)果顯示,mPDT處理后3h,細胞內(nèi)即出現(xiàn)大量晚期自噬體,而aPDT處理后3h-12h,則主要是早期自噬體。Western Blot結(jié)果表明,在mPDT處理后3h,與aPDT相比,LC3-Ⅱ/Ⅰ的比率前者是后者的2.15倍。4.研制的mPDT栓劑試劑盒滿足實驗要求。ALA栓劑于37℃可在30min內(nèi)軟化無硬心,直腸給藥后靶向聚集在腫瘤部位;LED直腸栓光源的電功率為0.2W,輸出的光功率密度為20mW/cm2,能實現(xiàn)長時間穩(wěn)定輸出。5.mPDT在體腫瘤治療的總體有效率是60%。mPDT治療后第7天,腫瘤體積降低到50%左右,第14天時幾乎消除。HE染色結(jié)果顯示,只有6.16%的腫瘤組織在mPDT治療后殘留;TUNEL染色結(jié)果顯示,mPDT處理后細胞凋亡率為 18.9%。結(jié)論:體外和體內(nèi)實驗均顯示與aPDT相比,ALA-mPDT對直腸癌細胞有顯著的的抑制效果,發(fā)生于早期的嚴(yán)重的凋亡和自噬是其主要作用機制。mPDT在人直腸癌的臨床治療中可能成為一種新的優(yōu)于aPDT的選擇,PDT栓劑試劑盒將很大程度上改善目前光動力治療的效果。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.37
【圖文】：

細胞壓力的生存反應(yīng)。但是，研究也表明，自噬的發(fā)生有時會導(dǎo)致細胞死亡７〃５。逡逑此外，自噬性的細胞死亡具有不同于細胞凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)和生化特征Ｍ。如逡逑圖１．３所示，即為自噬過程中關(guān)鍵的細胞變化。逡逑７逡逑

ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｂｌｅｂｓ邐ｖ９逡逑圖１．２細胞凋亡過程６５逡逑目前，大量研究表明，ＰＤＴ處理后引起的細胞死亡主要是通過凋亡和壞死逡逑介導(dǎo)的。與壞死（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ，一種由急性細胞損傷導(dǎo)致的創(chuàng)傷性細胞死亡）不同，逡逑細胞凋亡是一種高度調(diào)節(jié)和控制的過程，在機體生命周期中具有優(yōu)勢。細胞凋亡逡逑一旦開始就不能停止，這是一個高度調(diào)控的過程。細胞凋亡可以通過下列兩條途逡逑徑之一進行：在內(nèi)源性途徑中，線粒體由于外膜通透性發(fā)生變化而向細胞內(nèi)釋放逡逑細胞色素ｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ，Ｃｙｔｃ）及其他調(diào)亡因子，這些因子與ｃａｓｐａｓｅ９前體結(jié)逡逑合形成凋亡復(fù)合物從而激活ｃａｓｐａｓｅ邋９并啟動下游的ｃａｓｐａｓｅ級聯(lián)反應(yīng)在外源逡逑性途徑中，細胞膜表面的死亡受體（Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ等）與相應(yīng)的死亡配體（主要逡逑指腫瘤壞死因子家族成員）結(jié)合后激活ｃａｓｐａｓｅ邋８

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉忠濤;熊力;文宇;;光動力治療與細胞自噬的研究進展[J];中國激光醫(yī)學(xué)雜志;2013年06期

2 謝瑩;黃光武;韋正波;張哲;溫文勝;;5-ALA光動力療法治療裸鼠鼻咽癌移植瘤的療效觀察[J];中國激光醫(yī)學(xué)雜志;2009年02期

本文編號：2726967