【摘要】：研究目的構(gòu)建mPGES-1-RNAi慢病毒(前列腺素E2合成酶-1-RNAi)并感染肝癌細(xì)胞,觀察干擾mPGES-1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC7721和HepG_2體外增殖、遷移和侵襲能力的影響。采用miRNAs芯片方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG_2 mPGES-1基因被干擾后miRNAs差異表達(dá)情況,并加以驗(yàn)證以及相關(guān)分析,以期發(fā)現(xiàn)mPGES-1介導(dǎo)miRNAs信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌惡性進(jìn)展中的作用及可能的分子機(jī)制。研究方法(1)構(gòu)建mPGES-1-RNAi慢病毒并分別感染肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG_2,同時(shí)設(shè)置空載體組(NC組)和未感染組(Control組)。采用Western blot、PCR等方法檢測(cè)干擾mPGES-1基因前后肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG_2中mPGES-1mRNA及蛋白的表達(dá)水平。運(yùn)用CCK-8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾mPGES-1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC7721和HepG_2增殖、遷移和侵襲能力的影響。(2)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)干擾肝癌細(xì)胞株SMMC7721和HepG_2mPGES-1前后前列腺素E_2(PGE2)的含量。(3)采用miRNAs芯片篩選干擾肝癌細(xì)胞株HepG_2 mPGES-1基因后顯著差異表達(dá)miRNAs,同時(shí)用qPCR加以驗(yàn)證,對(duì)差異表達(dá)最顯著的miR-146a-5p用TargetScan、PITA、microRNAorg數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)取交集后的共同靶基因進(jìn)行后續(xù)的GO和KEGG Pathway分析。(4)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)mPGES-1、cyclinD1和EGFR在肝癌組織和癌旁肝組織的表達(dá)情況,并分析它們之間的相關(guān)性。研究結(jié)果(1)成功構(gòu)建mPGES-1-RNAi慢病毒并感染肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG_2,SMMC7721的病毒感染率約為80%,HepG_2的病毒感染率約為90%。(2)與未感染組(Control組)、空載體組(NC組)相比,肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG_2中mPGES-1基因干擾組(LV-2組)mPGES-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)與未感染組(Control組)、空載體組(NC組)相比,肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG_2中mPGES-1基因干擾組(LV-2組)PGE_2含量明顯下調(diào),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)CCK8實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG_2中,mPGES-1基因干擾組(LV-2組)與未感染組(Control組)和空載體組(NC組)相比,細(xì)胞增殖、侵襲能力明顯減弱,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在肝癌細(xì)胞SMMC7721中,相對(duì)未感染組(Control組)與空載體組(NC組),mPGES-1基因干擾組(LV-2組)細(xì)胞遷移能力明顯減弱,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在肝癌細(xì)胞株HepG_2中,相對(duì)未感染組(Control組)與空載體組(NC組),mPGES-1基因干擾組(LV-2組)細(xì)胞遷移能力有所下調(diào),但差異統(tǒng)計(jì)無(wú)學(xué)意義(P0.05)。(6)miRNAs芯片篩選顯著差異表達(dá)miRNAs與qPCR驗(yàn)證結(jié)果相對(duì)比:miR-146a-5p、miR-6889-5p、miR-3150b-3p、miR-4470表達(dá)上調(diào);miR-20a-3p、miR-23a-5p、miR-629-5p、miR-7-1-3p、miR-6820-3p表達(dá)下調(diào),以上結(jié)果與miRNA芯片結(jié)果相一致,其中上調(diào)miRNAs中miR-146a-5p改變最明顯,上調(diào)倍數(shù)為4.12,下調(diào)miRNAs中miR-7-1-3p改變最明顯,下調(diào)倍數(shù)為3.70。但miR-5191、miR-2276-3p、miR-892b表達(dá)上調(diào),miR-521表達(dá)下調(diào),這4個(gè)miRNAs的表達(dá)情況與芯片結(jié)果不一致。(7)差異表達(dá)最顯著miR-146a-5p的靶基因預(yù)測(cè)及對(duì)靶基因的GO分析和KEGG分析結(jié)果顯示:miR-146a-5p的候選靶基因有120個(gè),有cyclinD1、EGFR等;且miR-146a-5p的靶基因主要調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、小GTPase介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脫磷酸作用、T細(xì)胞激活等生物學(xué)行為,主要富集在:腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等。(8)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:mPGES-1在肝癌組織中高表達(dá)率高于癌旁肝組織(77.78%vs.53.70%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);cyclinD1在肝癌組織中高表達(dá)率高于癌旁肝組織(12.96%vs.1.85%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);EGFR在癌旁肝組織中的高表達(dá)率高于肝癌組織(38.89%vs.72.22%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)mPGES-1、cyclinD1、EGFR三者的相關(guān)性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:mPGES-1與cyclinD1呈正相關(guān)、與EGRF呈負(fù)相關(guān),同時(shí)cyclinD1與EGFR呈負(fù)相關(guān),且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。研究結(jié)論(1)成功構(gòu)建mPGES-1-RNAi慢病毒載體,高效感染肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG_2,可穩(wěn)定、顯著的降低mPGES-1基因的表達(dá)。(2)干擾mPGES-1基因可以減弱肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。(3)干擾肝癌細(xì)胞HepG_2 mPGES-1基因前后miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生改變,mPGES-1可能通過(guò)miR-146a-5p靶向cyclin D1和EGFR影響肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7
【圖文】：

結(jié) 果的選擇 技術(shù)檢測(cè)人肝癌細(xì)胞株 HepG2、SMMC7721、MHES-1 在 mRNA 水平上的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S-1 的表達(dá)量不同，SMMC7721 表達(dá)量最高，HepG2達(dá)量最低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇高表達(dá) mPGES-1 epG2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。mPGES-1 mRNA 在各株人肝癌 1.2。

圖 1.3 慢病毒感染 SMMC-7721 細(xì)胞的病毒感染率（NC：空載體組 LV-1：慢病毒干擾組 1 LV-2：慢病毒干擾組 2圖 a,b,c 為明場(chǎng)視野；圖 d,e,f 為熒光視野）Figure1.3 Virus infection rate of SMMC-7721 cells infected by lentivirus

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2726388