【摘要】：研究背景及目的:乳腺癌作為女性所罹患惡性腫瘤中最常見的病種之一,約占所有惡性腫瘤的30%。盡管包括手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療在內(nèi)的綜合治療顯著降低了早期死亡率,但乳腺癌仍然是女性癌癥死亡最常見原因中的第二位。惡性腫瘤的發(fā)生是由多種致癌因素引起的,其特點(diǎn)是細(xì)胞增殖失控和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。骨是晚期乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位,據(jù)報(bào)道發(fā)生率約為60-80%,骨轉(zhuǎn)移大大增加了病理性骨折和脊髓壓迫等并發(fā)癥,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。鑒于晚期乳腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的后續(xù)治療策略及療效較為有限。故探明乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制,尋求新的藥理學(xué)靶點(diǎn),對患者的預(yù)后意義重大。微纖維相關(guān)蛋白5(Microfibrillar-associated protein 5,MFRP5)也稱為微纖維相關(guān)糖蛋白2(microfibril-associated glycoprotein 2,MAGP2),是細(xì)胞外彈性微纖維的一個(gè)組成部分,在骨骼生長、心血管發(fā)育、肺泡彈性發(fā)育和馬凡綜合征中發(fā)揮重要作用。研究表明,MFAP5由骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC)分泌,并在造血和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用,而MFAP5的缺失可預(yù)防小鼠骨質(zhì)疏松。這些結(jié)果表明MFAP5在骨微環(huán)境中的關(guān)鍵作用。最近的研究進(jìn)一步表明,MFAP5在頭頸部惡性腫瘤、胰腺癌、肺癌和舌癌中過度表達(dá),但是MFAP5在這些腫瘤中的作用仍有待闡明。已有研究表明,血清MFAP5水平與卵巢癌患者預(yù)后負(fù)相關(guān),而癌細(xì)胞分泌的MFAP5能夠促進(jìn)腫瘤增殖,內(nèi)皮細(xì)胞遷移,腫瘤血管生成和化療藥物耐藥。然而,課題組成員經(jīng)過文獻(xiàn)檢索,發(fā)現(xiàn)關(guān)于MFAP5在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制的文獻(xiàn)尚屬少數(shù)。由于MFAP5在惡性腫瘤和骨微環(huán)境中的重要作用,我們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),想進(jìn)一步了解MFAP5在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用。在本研究中,我們首先驗(yàn)證了MFAP5在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中的高表達(dá),并探究了MFAP5對乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響,并進(jìn)一步探討了可能的分子機(jī)制,特別是ERK/MMP信號通路。研究方法:我們的研究采用在海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院收集的乳腺癌原發(fā)病灶、癌旁正常組織及骨轉(zhuǎn)移組織。首先,我們進(jìn)行MFAP5的免疫組化染色,隨后通過western blot及q R-T PCR實(shí)驗(yàn),分別在蛋白水平和m RNA水平驗(yàn)證MFAP5的表達(dá)。第二部分的實(shí)驗(yàn)中,我們首先構(gòu)建MFAP5過表達(dá)質(zhì)粒,并通過PCR擴(kuò)增的MFAP5的密碼序列插入pcDNA3.1+質(zhì)粒中。一方面進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn):在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)兩珠乳腺癌細(xì)胞系MCF7和MDA-MB-231,細(xì)胞用DNA轉(zhuǎn)染試劑或si RNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。用過表達(dá)質(zhì)�；騭i RNA轉(zhuǎn)染的MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞以每孔5×103的起始密度接種在96孔板中,48h后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒進(jìn)行計(jì)數(shù),使用酶標(biāo)儀在450nm處測量吸光度來測量結(jié)果。隨后,我們使用8-μm孔徑的transwell室進(jìn)行transwell遷移試驗(yàn)。消化并計(jì)數(shù)用過表達(dá)(OE)質(zhì)粒或si RNA轉(zhuǎn)染的MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞。為進(jìn)一步研究MFAP5調(diào)控乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,我們進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn),研究MFAP5與MMP2,MMP9,p-FAK,FAK,p-Erk1/2,Erk1/2,p-c Jun(Ser63),p-c Jun(Ser73),c Jun之間表達(dá)的相互影響及關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中,均使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)格式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,數(shù)據(jù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,并納入代表性結(jié)果。p0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。結(jié)果:IHC顯示MFAP5主要在細(xì)胞間隙中表達(dá),并且在骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)顯著高于原發(fā)灶。western blot檢測進(jìn)一步證實(shí)MFAP5在骨轉(zhuǎn)移中的表達(dá)高于原發(fā)灶。此外,q RT-PCR檢測結(jié)果顯示,在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中MFAP5的m RNA水平顯著高于原發(fā)灶(p0.05)。MFAP5在MDA-MB-231細(xì)胞中MFAP5的表達(dá)水平最高,在MCF7細(xì)胞中最低。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了過表達(dá)質(zhì)粒和si RNA分別對MFAP5的表達(dá)起到促進(jìn)及抑制作用。MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中進(jìn)行的CCK8實(shí)驗(yàn)顯示,MFAP5過表達(dá)后細(xì)胞活力明顯增強(qiáng),而抑制MFAP5后細(xì)胞增殖明顯下調(diào),表明MFAP5介導(dǎo)乳腺癌的細(xì)胞增殖。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,MFAP5過表達(dá)的細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng),而抑制MFAP5后,細(xì)胞遷移能力顯著降低。這些結(jié)果提示MFAP5可能通過增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力而促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。在MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中,MFAP5過表達(dá)時(shí)MMP2和MMP9的m RNA水平顯著增高,而MMP7和MMP14的m RNA水平幾乎不變。Western blot進(jìn)一步表明,與OE-Ctrl質(zhì)粒相比,轉(zhuǎn)染OE-MFAP5質(zhì)粒的MMP2和MMP9的表達(dá)顯著上調(diào),相反,si RNA對MFAP5的抑制則明顯抑制了MMP2和MMP9的表達(dá)。這些結(jié)果表明MFAP5可能通過調(diào)節(jié)MMP2和MMP9的表達(dá)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。MFAP5的過表達(dá)對FAK,Erk1/2和c Jun的表達(dá)無明顯影響,但MFAP5明顯激活了FAK,Erk1/2和c Jun的磷酸化。相反,通過si RNAs抑制MFAP5的表達(dá)則明顯抑制了p-FAK,p-Erk1/2和p-c Jun的表達(dá)。這些結(jié)果提示MFAP5可能通過ERK信號通路調(diào)控MMP2和MMP9的表達(dá)。結(jié)論:通過本研究,我們首先報(bào)道了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中MFAP5表達(dá)水平相比原發(fā)灶的明顯上調(diào),并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MFAP5過表達(dá)加速了乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,而當(dāng)MFAP5被抑制時(shí)則呈現(xiàn)相反的效果。此外,MFAP5能夠能激活ERK信號通路,增加MMP2和MMP9的表達(dá),相反,抑制MFAP5的表達(dá)后,MMP2、MMP9、p-FAK、p-Erk1/2和p-c Jun的表達(dá)也受到抑制。這些結(jié)果表明MFAP5作為癌基因在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用,希望通過我們的研究能夠找到乳腺癌骨轉(zhuǎn)移新的診斷和治療方法。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

測MFAP5分別在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶、乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織中的表達(dá)。 結(jié)果顯示，MFAP5主要在細(xì)胞間隙中表達(dá)，并且在骨轉(zhuǎn)移灶中與乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織相比顯著上調(diào)（圖1-1）。western blot檢測進(jìn)一步證實(shí)MFAP5在骨轉(zhuǎn)移中的表達(dá)高于乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織（圖1-2）。我們進(jìn)一步提取三種組織的總RNA，qRT-PCR檢測RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，根據(jù)結(jié)果，在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中MFAP5的mRNA水平顯著高于原發(fā)灶及瘤旁組織（p <0.05）（圖1-3）。圖 1-1：IHC 染色檢測 MFAP5 在乳腺癌瘤旁組織、原發(fā)灶及骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)圖 1-2：western blot 檢測 MFAP5 在乳腺癌瘤旁組織、原發(fā)灶及骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)

MFAP5主要在細(xì)胞間隙中表達(dá)，并且在骨轉(zhuǎn)移灶中與乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織相比顯著上調(diào)（圖1-1）。western blot檢測進(jìn)一步證實(shí)MFAP5在骨轉(zhuǎn)移中的表達(dá)高于乳腺癌原發(fā)灶及瘤旁組織（圖1-2）。我們進(jìn)一步提取三種組織的總RNA，qRT-PCR檢測RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，根據(jù)結(jié)果，在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶中MFAP5的mRNA水平顯著高于原發(fā)灶及瘤旁組織（p <0.05）（圖1-3）。圖 1-1：IHC 染色檢測 MFAP5 在乳腺癌瘤旁組織、原發(fā)灶及骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)圖 1-2：western blot 檢測 MFAP5 在乳腺癌瘤旁組織、原發(fā)灶及骨轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)

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本文編號：2726276