發(fā)布時間：2020-06-22 19:06

【摘要】：目的:Bruton酪氨酸激酶(Bruton Tyrosine Kinase,BTK)是B細胞受體信號通路(B Cell Receptor,BCR)的重要組成分子,介導B細胞的遷移、趨化、粘附,并促進B細胞惡性腫瘤的增殖、生存及耐藥。依魯替尼是BTK一種小分子抑制劑,并已被FDA批準應用于慢性淋巴細胞白血病的一線治療和套細胞淋巴瘤的二線治療。本研究擬通過DLBCL細胞系和DLBCL患者原代細胞探討依魯替尼誘導DLBCL凋亡及克服DLBCL耐藥的作用機制。方法:1.用不同劑量的依魯替尼分別處理DLBCL細胞后,MTS法測出細胞增殖抑制率,膜聯(lián)蛋白V/碘化吡啶染色和流式細胞術(shù)檢測和分析DLBCL細胞凋亡情況;DAPI染色法觀察細胞核變化情況;蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測DLBCL細胞裂解產(chǎn)物中BCL-2等的水平。2.DLBCL細胞與MSC共培養(yǎng)后,顯微鏡下計數(shù)向MSC趨化遷移的DLBCL細胞數(shù)及與MSC粘附的DLBCL細胞數(shù);酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測MSC分泌CXCL-12的情況;流式細胞術(shù)檢測DLBCL細胞CXCR4蛋白的表達;用攜帶有CXCR4的慢病毒轉(zhuǎn)染DLBCL細胞后,再與MSC共培養(yǎng),米托蒽醌和/或依魯替尼對共培養(yǎng)的DLBCL細胞進行處理,膜聯(lián)蛋白V/碘化吡啶染色檢測DLBCL細胞凋亡;3.在MethoCult甲基纖維素培養(yǎng)基上將DLBCL細胞與MSC共培養(yǎng)后,用依魯替尼進行處理,倒置顯微鏡觀察DLBCL細胞體外克隆形成;將DLBCL細胞和MSC共同注射于NOD/SCID模型小鼠皮下,腹腔注射依魯替尼2.5mg/kg/天進行治療,定期測量腫瘤生長情況。結(jié)果:1.依魯替尼處理DLBCL細胞后,細胞增殖受到抑制并出現(xiàn)凋亡,并隨依魯替尼劑量增加而增強,呈現(xiàn)劑量依賴性;細胞出現(xiàn)核濃縮、細胞皺縮的凋亡形態(tài)改變;促凋亡蛋白BAD、BAX等的表達上調(diào)和抗凋亡蛋白如BCL-2、BCL-CL、MCL1等的水平受到抑制,caspase-3活化水平增加,引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解的級聯(lián)反應,PARP被裂解失去活力,BTK、AKT、ERK的表達水平下調(diào),磷酸化活化被抑制,BCR信號通路被阻斷。2.MSC促進DLBCL細胞向MSC的遷移和粘附,依魯替尼抑制DLBCL細胞向MSC的遷移和DLBCL細胞與MSC的粘附,并呈劑量依賴性;MSC上調(diào)DLBCL細胞CXCR4的表達,DLBCL細胞促進MSC CXCL12的分泌,依魯替尼抑制DLBCL細胞促進的CXCL12的分泌和MSC上調(diào)的CXCR4的表達;病毒轉(zhuǎn)染后,DLBCL細胞出現(xiàn)CXCR4過表達,與MSC共培養(yǎng)后,米托蒽醌誘導DLBCL細胞凋亡的比例降低,加入依魯替尼后,共培養(yǎng)體系凋亡率上升,說明依魯替尼克服MSC介導的耐藥作用;3.MSC促進DLBCL細胞的體外克隆形成和DLBCL細胞的體內(nèi)增殖生長,依魯替尼抑制共培養(yǎng)時DLBCL細胞的體外克隆形成(P0.01)并抑制DLBCL細胞在體內(nèi)的增殖生長(P0.05)。結(jié)論:依魯替尼具有直接抗腫瘤作用,通過提高促凋亡蛋白BAD、BAX等的表達和抑制抗凋亡蛋白如BCL-2、BCL-CL、MCL1等的水平激活caspase-3,引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解的級聯(lián)反應,裂解PARP,誘導DLBCL細胞凋亡。在腫瘤微環(huán)境MSC介導的DLBCL細胞耐藥的機制中,CXCL12/CXCR4軸是關(guān)鍵的媒介,依魯替尼抑制CXCL12、CXCR4的分泌和表達水平,從而抑制該功能軸,進而克服DLBCL細胞的耐藥作用。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.1
【圖文】：

圖 1.依魯替尼對 SUDHL-4、SUDHL-10、OCI-LY10、HBL-1 細胞增殖抑制作用的劑量依賴性。依魯替尼濃度為 0、2.5、5、7.5μM。隨劑量增加細胞抑制率增加。圖 2. 依魯替尼誘導 SUDHL-4、SUDHL-10、OCI-LY10、HBL-1 細胞凋亡作用的劑量依賴性。依魯替尼濃度為 0、2.5、5μM。隨劑量增加細胞凋亡比例增加。

ERK 的表達水平和磷酸化活化也被抑制，引起 BCR 受體信號通路功能異常，細胞增殖、生存的受到干擾、抑制。圖 1.依魯替尼對 SUDHL-4、SUDHL-10、OCI-LY10、HBL-1 細胞增殖抑制作用的劑量依賴性。依魯替尼濃度為 0、2.5、5、7.5μM。隨劑量增加細胞抑制率增加。

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本文編號：2726111