發(fā)布時(shí)間：2020-06-22 19:06

【摘要】：目的:Bruton酪氨酸激酶(Bruton Tyrosine Kinase,BTK)是B細(xì)胞受體信號(hào)通路(B Cell Receptor,BCR)的重要組成分子,介導(dǎo)B細(xì)胞的遷移、趨化、粘附,并促進(jìn)B細(xì)胞惡性腫瘤的增殖、生存及耐藥。依魯替尼是BTK一種小分子抑制劑,并已被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于慢性淋巴細(xì)胞白血病的一線治療和套細(xì)胞淋巴瘤的二線治療。本研究擬通過(guò)DLBCL細(xì)胞系和DLBCL患者原代細(xì)胞探討依魯替尼誘導(dǎo)DLBCL凋亡及克服DLBCL耐藥的作用機(jī)制。方法:1.用不同劑量的依魯替尼分別處理DLBCL細(xì)胞后,MTS法測(cè)出細(xì)胞增殖抑制率,膜聯(lián)蛋白V/碘化吡啶染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分析DLBCL細(xì)胞凋亡情況;DAPI染色法觀察細(xì)胞核變化情況;蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)DLBCL細(xì)胞裂解產(chǎn)物中BCL-2等的水平。2.DLBCL細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)后,顯微鏡下計(jì)數(shù)向MSC趨化遷移的DLBCL細(xì)胞數(shù)及與MSC粘附的DLBCL細(xì)胞數(shù);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)MSC分泌CXCL-12的情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DLBCL細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá);用攜帶有CXCR4的慢病毒轉(zhuǎn)染DLBCL細(xì)胞后,再與MSC共培養(yǎng),米托蒽醌和/或依魯替尼對(duì)共培養(yǎng)的DLBCL細(xì)胞進(jìn)行處理,膜聯(lián)蛋白V/碘化吡啶染色檢測(cè)DLBCL細(xì)胞凋亡;3.在MethoCult甲基纖維素培養(yǎng)基上將DLBCL細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)后,用依魯替尼進(jìn)行處理,倒置顯微鏡觀察DLBCL細(xì)胞體外克隆形成;將DLBCL細(xì)胞和MSC共同注射于NOD/SCID模型小鼠皮下,腹腔注射依魯替尼2.5mg/kg/天進(jìn)行治療,定期測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果:1.依魯替尼處理DLBCL細(xì)胞后,細(xì)胞增殖受到抑制并出現(xiàn)凋亡,并隨依魯替尼劑量增加而增強(qiáng),呈現(xiàn)劑量依賴性;細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮、細(xì)胞皺縮的凋亡形態(tài)改變;促凋亡蛋白BAD、BAX等的表達(dá)上調(diào)和抗凋亡蛋白如BCL-2、BCL-CL、MCL1等的水平受到抑制,caspase-3活化水平增加,引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解的級(jí)聯(lián)反應(yīng),PARP被裂解失去活力,BTK、AKT、ERK的表達(dá)水平下調(diào),磷酸化活化被抑制,BCR信號(hào)通路被阻斷。2.MSC促進(jìn)DLBCL細(xì)胞向MSC的遷移和粘附,依魯替尼抑制DLBCL細(xì)胞向MSC的遷移和DLBCL細(xì)胞與MSC的粘附,并呈劑量依賴性;MSC上調(diào)DLBCL細(xì)胞CXCR4的表達(dá),DLBCL細(xì)胞促進(jìn)MSC CXCL12的分泌,依魯替尼抑制DLBCL細(xì)胞促進(jìn)的CXCL12的分泌和MSC上調(diào)的CXCR4的表達(dá);病毒轉(zhuǎn)染后,DLBCL細(xì)胞出現(xiàn)CXCR4過(guò)表達(dá),與MSC共培養(yǎng)后,米托蒽醌誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞凋亡的比例降低,加入依魯替尼后,共培養(yǎng)體系凋亡率上升,說(shuō)明依魯替尼克服MSC介導(dǎo)的耐藥作用;3.MSC促進(jìn)DLBCL細(xì)胞的體外克隆形成和DLBCL細(xì)胞的體內(nèi)增殖生長(zhǎng),依魯替尼抑制共培養(yǎng)時(shí)DLBCL細(xì)胞的體外克隆形成(P0.01)并抑制DLBCL細(xì)胞在體內(nèi)的增殖生長(zhǎng)(P0.05)。結(jié)論:依魯替尼具有直接抗腫瘤作用,通過(guò)提高促凋亡蛋白BAD、BAX等的表達(dá)和抑制抗凋亡蛋白如BCL-2、BCL-CL、MCL1等的水平激活caspase-3,引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解的級(jí)聯(lián)反應(yīng),裂解PARP,誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞凋亡。在腫瘤微環(huán)境MSC介導(dǎo)的DLBCL細(xì)胞耐藥的機(jī)制中,CXCL12/CXCR4軸是關(guān)鍵的媒介,依魯替尼抑制CXCL12、CXCR4的分泌和表達(dá)水平,從而抑制該功能軸,進(jìn)而克服DLBCL細(xì)胞的耐藥作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733.1
【圖文】：

圖 1.依魯替尼對(duì) SUDHL-4、SUDHL-10、OCI-LY10、HBL-1 細(xì)胞增殖抑制作用的劑量依賴性。依魯替尼濃度為 0、2.5、5、7.5μM。隨劑量增加細(xì)胞抑制率增加。圖 2. 依魯替尼誘導(dǎo) SUDHL-4、SUDHL-10、OCI-LY10、HBL-1 細(xì)胞凋亡作用的劑量依賴性。依魯替尼濃度為 0、2.5、5μM。隨劑量增加細(xì)胞凋亡比例增加。

ERK 的表達(dá)水平和磷酸化活化也被抑制，引起 BCR 受體信號(hào)通路功能異常，細(xì)胞增殖、生存的受到干擾、抑制。圖 1.依魯替尼對(duì) SUDHL-4、SUDHL-10、OCI-LY10、HBL-1 細(xì)胞增殖抑制作用的劑量依賴性。依魯替尼濃度為 0、2.5、5、7.5μM。隨劑量增加細(xì)胞抑制率增加。

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本文編號(hào)：2726111