【摘要】：目的肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥。MLLT3,也被稱為AF9,最初在急性髓系白血病中作為混合譜系白血病基因MLL的融合伙伴,由染色體異位形成的MLL-AF9融合基因是急性髓系白血病患者11q23易位中最常見的一種,目前MLLT3的功能尚未完全明確,本課題的研究目的是探索MLLT3在肺腺癌中的潛在生物學(xué)功能及分子機(jī)制。方法(1)應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)MLLT3在74對(duì)肺腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異,通過免疫組化染色的評(píng)分情況分析MLLT3在組織中的表達(dá)強(qiáng)度,將74例組織標(biāo)本劃分為高表達(dá)組及低表達(dá)組,進(jìn)一步分析MLLT3的表達(dá)情況與臨床參數(shù)的關(guān)系;通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)MLLT3在人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9、A549、H1299和H1975及人正常支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞BEAS-2B中的表達(dá)差異,篩選出MLLT3高表達(dá)細(xì)胞株A549和NCI-H1299。(2)根據(jù)MLLT3的基因序列設(shè)計(jì)小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染A549和NCI-H1299細(xì)胞,MLLT3在肺腺癌細(xì)胞中的功能通過CCK8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè);在機(jī)制研究中,采用Western blot技術(shù)檢測(cè)MLLT3調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞周期、凋亡及EMT相關(guān)分子標(biāo)記在蛋白水平的變化。(3)構(gòu)建包含短發(fā)夾RNA(shRNA)的慢病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞沉默MLLT3基因的表達(dá),采用裸鼠皮下瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行MLLT3基因敲減后體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究。結(jié)果(1)免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明MLLT3在肺腺癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度高于癌旁組織,MLLT3的表達(dá)和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及肺癌的TNM分期有關(guān),生存分析顯示MLLT3高表達(dá)與肺腺癌患者總體生存期呈負(fù)相關(guān)。(2)MLLT3在A549和NCI-H1299細(xì)胞中高表達(dá),通過siRNA敲減MLLT3可顯著抑制A549和NCI-H1299細(xì)胞的增殖能力及平板克隆形成能力,也可顯著抑制A549和NCI-H1299細(xì)胞的遷徙和侵襲能力,采用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示敲減MLLT3后A549和NCI-H1299細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞和凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著增多,S期細(xì)胞比例較對(duì)照組減少;進(jìn)一步的機(jī)制研究中,EGFR-MAPK/ERK通路相關(guān)蛋白p-EGFR、p-ERK、p-MEK、cmyc及EMT相關(guān)分子標(biāo)記,包括間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin、N-cadherin的表達(dá)水平下調(diào),上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin和p21的表達(dá)水平上調(diào);凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP的表達(dá)水平上調(diào),周期相關(guān)蛋白CDK4、CyclinD表達(dá)下調(diào)。(3)裸鼠皮下瘤實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染包含靶向MLLT3短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒組的裸鼠皮下瘤生長速率較包含無義序列短發(fā)夾RNA慢病毒組減慢,皮下瘤重量較對(duì)照組組顯著減輕。結(jié)論(1)MLLT3在肺腺癌組織顯著高表達(dá),與肺腺癌患者的臨床病理因素以及總體生存期相關(guān)。(2)MLLT3在肺腺癌進(jìn)展中起促癌作用,有可能成為一個(gè)潛在的預(yù)后判斷因素和治療的靶點(diǎn)。(3)EGFR-MAPK/ERK通路參與MLLT3對(duì)肺腺癌作用的過程。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2
【圖文】：

17圖 1-1 MLLT3 在配對(duì)的人肺腺癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況Figure1-1: Relative MLLT3 expression in LUAD tissues and their corressponding non-tumtissues. * p < 0.05， ** p < 0.013.2 MLLT3 在肺腺癌患者癌組織中的表達(dá)水平與肺腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)為進(jìn)一步探究 MLLT3 是否影響肺腺癌患者的不良預(yù)后，如表 1-4 所示，我們分析了 MLLT3 的表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。我們共有 74 例腺癌患者的組織標(biāo)本，我們將 74 例肺腺癌患者根據(jù)病理切片的免疫組化染色分情況分為 MLLT3 高表達(dá)組(45/72)和 MLLT3 低表達(dá)組(29/72)，卡方檢驗(yàn)結(jié)果明 MLLT3 蛋白表達(dá)水平與肺腺癌患者的腫瘤有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(p= 0.019)和腫瘤TNM 分期(p = 0.005)相關(guān)，但是與患者的年齡、性別、腫瘤大小、是否合并淋結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(p＞0.05)，此外，如圖 1-3 所示，我們結(jié)合肺腺癌患者的生存隨訪數(shù)據(jù)，采用 Kaplan-Meier 生存分析法分析了 MLLT3 表達(dá)水平與肺腺癌患

：MLLT3 的表達(dá)水平與肺腺癌患者總體生存期的相關(guān)性分析e1-3: Kaplan-Meier analyses of overall survival according to MLLT3 expressry in LUAD patientsLLT3 蛋白在肺腺癌 A549 和 NCI-H1299 中高表達(dá)前面免疫組化結(jié)果表明 MLLT3 蛋白表達(dá)水平在肺腺癌患者癌組臨近癌旁組織，且 MLLT3 在肺癌組織中的表達(dá)水平和患者的預(yù)結(jié)果提示 MLLT3 可能在肺腺癌的進(jìn)展中起到促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展步驗(yàn)證 MLLT3 在肺腺癌中的生物學(xué)功能和機(jī)制，我們分別從 m水平驗(yàn)證 MLLT3 在 4 種肺腺癌細(xì)胞（PC9、A549、H1299 和 H正常支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）中的表達(dá)（圖 1-4），結(jié)果表明胞中 MLLT3 均呈顯著高表達(dá)，在 A549 細(xì)胞中表達(dá)最高，表達(dá)量 PC9 及人正常支氣管上皮細(xì)胞 BEAS-2B。因此我們選擇 MLLT的肺腺癌細(xì)胞 A549 和 NCI-H1299 進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)，MLLT3 肺腺癌細(xì)胞中的異常高表達(dá)狀態(tài)可能與肺腺癌的惡性表型有密切

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8 季晨陽,張義R

本文編號(hào)：2725698