【摘要】：目的肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥。MLLT3,也被稱為AF9,最初在急性髓系白血病中作為混合譜系白血病基因MLL的融合伙伴,由染色體異位形成的MLL-AF9融合基因是急性髓系白血病患者11q23易位中最常見的一種,目前MLLT3的功能尚未完全明確,本課題的研究目的是探索MLLT3在肺腺癌中的潛在生物學功能及分子機制。方法(1)應用免疫組化法檢測MLLT3在74對肺腺癌組織及癌旁組織中的表達差異,通過免疫組化染色的評分情況分析MLLT3在組織中的表達強度,將74例組織標本劃分為高表達組及低表達組,進一步分析MLLT3的表達情況與臨床參數的關系;通過實時熒光定量PCR和蛋白質印跡法(Western Blot)檢測MLLT3在人肺腺癌細胞株PC9、A549、H1299和H1975及人正常支氣管上皮細胞細胞BEAS-2B中的表達差異,篩選出MLLT3高表達細胞株A549和NCI-H1299。(2)根據MLLT3的基因序列設計小干擾RNA(siRNA)轉染A549和NCI-H1299細胞,MLLT3在肺腺癌細胞中的功能通過CCK8實驗、克隆形成實驗、Transwell實驗、劃痕實驗以及流式細胞術等方法檢測;在機制研究中,采用Western blot技術檢測MLLT3調控相關信號通路、細胞周期、凋亡及EMT相關分子標記在蛋白水平的變化。(3)構建包含短發(fā)夾RNA(shRNA)的慢病毒轉染A549細胞沉默MLLT3基因的表達,采用裸鼠皮下瘤實驗進行MLLT3基因敲減后體內實驗的研究。結果(1)免疫組化檢測結果表明MLLT3在肺腺癌組織中的表達強度高于癌旁組織,MLLT3的表達和有無遠處轉移及肺癌的TNM分期有關,生存分析顯示MLLT3高表達與肺腺癌患者總體生存期呈負相關。(2)MLLT3在A549和NCI-H1299細胞中高表達,通過siRNA敲減MLLT3可顯著抑制A549和NCI-H1299細胞的增殖能力及平板克隆形成能力,也可顯著抑制A549和NCI-H1299細胞的遷徙和侵襲能力,采用流式細胞技術分析細胞周期分布及細胞凋亡情況,結果顯示敲減MLLT3后A549和NCI-H1299細胞G0/G1期細胞和凋亡細胞比例較對照組顯著增多,S期細胞比例較對照組減少;進一步的機制研究中,EGFR-MAPK/ERK通路相關蛋白p-EGFR、p-ERK、p-MEK、cmyc及EMT相關分子標記,包括間質細胞標記物Vimentin、N-cadherin的表達水平下調,上皮細胞標記物E-cadherin和p21的表達水平上調;凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP的表達水平上調,周期相關蛋白CDK4、CyclinD表達下調。(3)裸鼠皮下瘤實驗中,轉染包含靶向MLLT3短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒組的裸鼠皮下瘤生長速率較包含無義序列短發(fā)夾RNA慢病毒組減慢,皮下瘤重量較對照組組顯著減輕。結論(1)MLLT3在肺腺癌組織顯著高表達,與肺腺癌患者的臨床病理因素以及總體生存期相關。(2)MLLT3在肺腺癌進展中起促癌作用,有可能成為一個潛在的預后判斷因素和治療的靶點。(3)EGFR-MAPK/ERK通路參與MLLT3對肺腺癌作用的過程。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

17圖 1-1 MLLT3 在配對的人肺腺癌及其癌旁組織中的表達情況Figure1-1: Relative MLLT3 expression in LUAD tissues and their corressponding non-tumtissues. * p < 0.05， ** p < 0.013.2 MLLT3 在肺腺癌患者癌組織中的表達水平與肺腺癌患者的不良預后有關為進一步探究 MLLT3 是否影響肺腺癌患者的不良預后，如表 1-4 所示，我們分析了 MLLT3 的表達水平與肺腺癌臨床病理特征的相關性。我們共有 74 例腺癌患者的組織標本，我們將 74 例肺腺癌患者根據病理切片的免疫組化染色分情況分為 MLLT3 高表達組(45/72)和 MLLT3 低表達組(29/72)，卡方檢驗結果明 MLLT3 蛋白表達水平與肺腺癌患者的腫瘤有無遠處轉移(p= 0.019)和腫瘤TNM 分期(p = 0.005)相關，但是與患者的年齡、性別、腫瘤大小、是否合并淋結轉移無相關性(p＞0.05)，此外，如圖 1-3 所示，我們結合肺腺癌患者的生存隨訪數據，采用 Kaplan-Meier 生存分析法分析了 MLLT3 表達水平與肺腺癌患

：MLLT3 的表達水平與肺腺癌患者總體生存期的相關性分析e1-3: Kaplan-Meier analyses of overall survival according to MLLT3 expressry in LUAD patientsLLT3 蛋白在肺腺癌 A549 和 NCI-H1299 中高表達前面免疫組化結果表明 MLLT3 蛋白表達水平在肺腺癌患者癌組臨近癌旁組織，且 MLLT3 在肺癌組織中的表達水平和患者的預結果提示 MLLT3 可能在肺腺癌的進展中起到促進腫瘤發(fā)生發(fā)展步驗證 MLLT3 在肺腺癌中的生物學功能和機制，我們分別從 m水平驗證 MLLT3 在 4 種肺腺癌細胞（PC9、A549、H1299 和 H正常支氣管上皮細胞（BEAS-2B）中的表達（圖 1-4），結果表明胞中 MLLT3 均呈顯著高表達，在 A549 細胞中表達最高，表達量 PC9 及人正常支氣管上皮細胞 BEAS-2B。因此我們選擇 MLLT的肺腺癌細胞 A549 和 NCI-H1299 進行接下來的實驗，MLLT3 肺腺癌細胞中的異常高表達狀態(tài)可能與肺腺癌的惡性表型有密切

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